过去的问题解答的整理。
为保留原风格，口头语气等均未修改，请原谅。

关于病毒载体种类的选择的问题
问：1.从载体的毒性对实验的影响来说，是逆转录还是腺病毒好呢？您说的MOI不太高的情况下没有显著毒性如何控制？没有显著毒性可以理解对实验没影响吗？我想设计实验这些都得考虑
2.从操作的难度可行性来说是逆转录要比腺病毒容易很多吗？因为是学生而且我们实验室没人做过病毒，一切都得自己摸索。
3.它俩的基本操作和花费是不都差不多呀？
答：我说操作难度上逆转录要比腺病毒和其它病毒载体容易,是指重组病毒的制备和纯化角度来说的，因为逆转录病毒载体的制备只需要获得一个载体和一个包装细胞株就可以自己开干。而腺病毒载体还存在重组出毒的问题。AAV的制备就更复杂更难一些。
病毒载体发展至今已经十几年了，其本身的探索性工作高峰已经过去，对大多数研究者来说它们仅仅是一个基因转移工具，在自己的研究工作中只代表工作量，并没有值得大写特写的地方。因此，把这样的工作委托出去，就象把测序、合成引物等工作交给别人做一样。
即便是委托出去，也要明白自己的实验目的和要求是什么，才能很好地选择，同时尽量节省经费。以腺病毒载体为例，可以这样选择：买穿梭质粒，自己做构建、鉴定和大提，交给公司做出毒、扩增和纯化和检测。根据自己的实验要求，可以选择精纯化，也可以选择粗纯化；条件好的可以选择自己做一部分检测。
至于你的实验是选择腺病毒好，还是逆转录或别的病毒载体好，主要还看你的实验目的，其次才是看那种病毒载体容易做。如果需要，你可以简要地把你的实验目的和设计PM给我，也许我能给你一点建议。

问：我想把一目的基因在体外培养的模型中过表达，前面TA克隆后，接下来用普通的表达载体就不可以了吧？是不需要一个基因转移载体？那是用病毒载体还是非病毒载体好呢？我也看过一些资料是不是用病毒载体好呢那是腺病毒还是逆转录病毒好呢？因为原来也没接触过这方面不知构建这样的载体大概需多少钱？（因为是学生考虑到经费的问题）另外还有个小问题，原来都是目的基因和T载体连接后质粒小提或大提后送去测序，最近有人建议我可以PCR之后再次用PCR产物PCR就可以送去测序，我不知各位高手认为如何？
答：首先，“过表达”是一个相对概念，可能是针对该基因在自然状态下的表达水平而言。因此，并不知道你所需要的表达水平如何。
如果用病毒载体，相对于逆转录病毒和AAV载体，腺病毒载体可能得到较高的目的基因表达水平。其他比较高表达的病毒载体还有甲病毒载体如SFV，痘病毒载体。仙台病毒载体SeV可以获得比腺病毒载体高几十倍的目的基因表达。
作为学生，比较好操作的病毒载体系统是逆转录病毒载体，腺病毒载体系统其次。不好做的是AAV载体系统。
用目的基因和T载体连接后质粒小提或大提后送去测序比较方便，但有些人担心自己的质粒会被别人留拷贝；PCR产物送去测序的缺点是万一出现点突变，就不知道是PCR的缘故还是基因真的有突变。

AAV病毒载体的开发和利用的问题
问：AAV病毒载体安全性最好，靶向性强，且能稳定的在体内表达，现被认为最有开发价值的转导系统。我国要好好的开发和利用这套系统关键是什么？
答：不仅是AAV系统，许多其它载体系统的问题是一样的。
在美国，95年以后就发展了许多vector core或者NGVL（国家载体实验室）这样的机构。专门为研究者制备载体。
研究者的主要精力应该用在挖金矿上，而不是制造工具上。许多研究生花了大部分的精力去构建载体和包装制备纯化病毒，实际上是很不划算的。没有把精力用在创新性的工作上，很可惜！
如果你的工作就是制造工具，那也不是要向别人要一套工具，而是需要创造更好的工具。
我在一个报告中说过，十年前，一个研究生重组出一个腺病毒，工作可以说是完成了一半；而现在，重组出一个腺病毒，工作才开始。

AAV载体，靶向性研究的热点主要也集中在这两方面：
1、对AAV病毒的外壳蛋白CAP基因进行改造，主要是在基因的某些位点插入特定短肽。依靠这些短肽来改变对细胞的亲嗜性。
2、用不同血清型的AAV病毒做载体。比如AAV1，AAV3，AAV5，AAV6等。GAO GP等甚至从细胞中扩增出几十种沉睡于基因组中的不同序列的AAV病毒CAP基因。
事实上，基因治疗处于其发展的早期，制订一个“聪明的方案”最为重要。
把载体比做工具的话，现实的情况是我们的工具还不够丰富，也不够精密。我们干活时要选择适合我们工具的活来干。
比如，法国人成功地开展了SCID的基因治疗，就在于他们选择了一个合适的疾病和一个合适的方案。这个病应该说是第一次得到了治愈的效果，是基因治疗的巨大成功。至于后来有2例患者又发生了白血病样变，是载体的安全性问题，是可以继续寻求解决方法的。

关于基因兴奋剂的问题
问：用AAV载体进行的基因兴奋剂，您认为对运动员的安全性如何？
答：可能首先是伦理学问题。
安全性则要考虑载体安全性和基因表达产物的安全性。
从目前已经在临床上开展的AAV载体介导的基因治疗报导来看，还没有出现安全性问题。
AAV的安全性问题主要集中在对染色体毒性既遗传毒性的考虑。具体体现在致瘤性和对生殖系统的影响上。AAV载体的安全性讨论仍在进行中。

关于AAV的安全性问题
问：关于腺相关病毒的安全性好像国内外还有争议：首先，有文献报道腺相关病毒进入宿主细胞后发生的整合既不是以前人们观察到的定点整合，也不是随机整合，而是整合在基因表达最为活跃的部位，故而有很大的可能性引发肿瘤。其次，有研究发现AAV能通过血睾屏障，影响个体的遗传特性，这将是一种无法预料的危险。不知你对这个问题有何看法？
答：2001年4月由NIH牵头，有30多个在美国做病毒载体和基因治疗的专家，聚集在WASHINGTON DC附近的一个小站ROCKVILLE（？记不很清楚了）的一个宾馆的会议室里，讨论了一天你说的这个问题。我当时在现场，也照了几张照片。
问题的提出是由于某个课题组实验中发现尾静脉注射了AAV的小鼠的睾丸中有基因转移的迹象。并且，其实验组的小鼠有致瘤倾向。
在当时普遍对AAV的安全性抱肯定状态和良好的应用情景的情况下，该问题的提出确实是一石激起千层浪，很受重视。因此，NIH组织了那次研讨会，当时在场的的中国人很少。
经过一天的讨论，会议给了几个阶段性意见：
1. 需要进行更多的、设计严格的动物实验；
2. 目前的实验结果并不能证明AAV透过了血睾屏障，进入到精曲小管的生发层，也没有证据表明这些小鼠的精子出现了基因转移；
3. 无法确切获得实验组的小鼠有致瘤倾向的结论，因为，该实验动物模型本身存在很多疑问，建议多做一些种类的模型动物上的实验。当时在这方面专家的争论非常密集。
因此，那次会议没有定论，只是建议需要更多的数据来说明各种可能。
其后，针对上述问题的实验一直都有人在从事，后续的实验结果和原来被提交的实验数据表明，实验小鼠的睾丸中所显示所转移的报告基因是在精曲小管之外的睾丸的血管中，也没有数据能进一步表明生殖细胞及精曲小管的生殖细胞的生发层有被基因转移的迹象。
其次，也没有进一步的文章表明AAV的感染能直接或间接地导致肿瘤。
对于AAV的安全性研究一直没有停止。由于它是一个具有整合能力的单链DNA病毒，因此关注其染色体毒性和遗传毒性是必然的，也是十分重要的。
实际上，专家并不回避这个“尖锐”的问题，而是关注。我们也开展这方面的研究。我的973课题就有这方面的内容。希望大家都能关注这方面的进展，并且提出见解，如果能开展一些实验研究就更好了。
References:
1、Nat Genet. 2004 Jul;36(7):767-73. Epub 2004 Jun 20.
Adeno-associated virus vectors integrate at chromosome breakage sites.
Miller DG, Petek LM, Russell DW.
Department of Pediatrics, Division of Genetics and Developmental Medicine, University of Washington, 1705 NE Pacific Street, Seattle, Washington 98195-7720, USA.
Adeno-associated virus (AAV) vectors transduce cells by multiple pathways, including integration at nonhomologous chromosomal locations by an unknown mechanism. We reasoned that spontaneous chromosome breaks may facilitate vector integration and investigated this in cells containing a specific chromosomal double-strand break created by the endonuclease I-SceI or multiple breaks created by treatment with etoposide or gamma-irradiation. Vector proviruses were found at I-SceI cleavage sites, and sequencing of vector-chromosome junctions detected microhomologies, deletions and insertions that were similar when integration occurred spontaneously at random locations or at induced double-strand breaks. Infection with AAV vectors did not increase mutation rates in normal human cells. Our results establish a mechanism for integration and suggest that AAV vectors can integrate at existing chromosome breaks rather than causing breaks themselves, which has implications for their clinical use.
PMID: 15208627 [PubMed - indexed for MEDLINE]
2、Nat Genet. 2003 Jul;34(3):297-302.
Comment in:
Nat Genet. 2003 Jul;34(3):241-2.
AAV serotype 2 vectors preferentially integrate into active genes in mice.
Nakai H, Montini E, Fuess S, Storm TA, Grompe M, Kay MA.
Department of Pediatrics, Stanford University School of Medicine, 300 Pasteur Dr. Rm G305A, Stanford, California 94305, USA.
Recombinant adeno-associated virus serotype 2 (rAAV2) is a promising vector for gene therapy because it can achieve long-term stable transgene expression in animals and human subjects after direct administration of vectors into various target tissues. In the liver, although stable transgene expression primarily results from extrachromosomal vector genomes, a series of experiments has shown that vector genomes integrate into host chromosomes in hepatocytes at a low frequency. Despite the low integration efficiency, recent reports of retroviral insertional mutagenesis in mice and two human subjects have raised concerns about the potential for rAAV2-mediated insertional mutagenesis. Here we characterize rAAV2-targeted chromosomal integration sites isolated from selected or non-selected hepatocytes in vector-injected mouse livers. We document frequent chromosomal deletions of up to 2 kb at integration sites (14 of 14 integrations, 100%; most of the deletions were <0.3 kb) and preferred integration into genes (21 of 29 integrations, 72%). In addition, all of the targeted genes analyzed (20 of 20 targeted genes, 100%) were expressed in the liver. This is the first report to our knowledge on host chromosomal effects of rAAV2 integration in animals, and it provides insights into the nature of rAAV2 vector integration into chromosomes in quiescent somatic cells in animals and human subjects.
PMID: 12778174 [PubMed - indexed for MEDLINE]

关于复制型的腺病毒的问题
问：，”复制型的腺病毒则需要更严格一些的条件？“是否意味着复制型腺病毒可以引起人类疾病，如果不注意的话？应该如何防范复制型的腺病毒呢？
答：将来对复制型的腺病毒或复制型的其它病毒可能会有更严格的规范。主要应考虑的问题是对机体的危害和对环境的危害。对生物恐怖的防范也成为关注的问题。
理论上，复制型的病毒再携带上某种特定作用的基因，有可能成为超自然的生物武器，不得不引起关注。
科学家的社会责任感是十分重要的。科学是有两面性的，用得不当会造成灾难。

关于腺病毒改造的问题
问：现在对腺病毒的改造，重点都放在fiber基因上，我想放在Hexon基因上改造载体，不知是否可行？或有哪些难点需要克服呢？
答：改fiber的人都是希望通过改造使病毒获得对细胞的不同的或新的亲嗜性，因为fiber是与受体结合的部分。不知道您为什么要改hexon。
关于基因的靶向性导入技术的研究进展，在病毒载体主要是集中在病毒外壳蛋白的改造和不同血清型病毒载体的应用。
如改造腺病毒的fiber基因，使纤突与不同受体结合；又比如35型腺病毒，比较5型腺病毒载体而言，对细胞的亲嗜性不同，受体也不同。

关于单纯疱疹病毒载体的问题
问：单纯疱疹病毒载体中枢神经系统应用免疫原性问题。
答：HSV1在中枢神经系统的应用研究已经有不少报导，HSV1是一种很好的嗜神经细胞载体，但缺点是细胞毒性比较明显。作为载体，往往是一次性注射，从动物实验来看HSV1的免疫原性并不干扰其转导效率。

关于利用载体进行RNA干扰技术、反义基因治疗研究的问题
问：利用RNA干扰技术在一个载体上携带两个不同基因的shRNA表达是否可行？
答：原则上是可行的。只是设计和构建启动子及RNAi分子、选择载体都很重要。

问：用AAV或者AV等病毒作为载体携带反义基因治疗肿瘤，有这方面的报道吗？可行性大吗？
我想用AAV作为载体进行某种反义基因治疗的载体，进行扩增，然后作动物实验。但国内反义治疗基本都是用lipofetin转染的，不知道可行吗？
答：事实上AAV或腺病毒载体都有用于携带反义核酸来阻断某些功能基因表达的成功研究报道。不仅是反义DNA，对于核酶基因和RNAi的编码DNA也都有用AAV或腺病毒为载体的报道。

关于了氯仿纯化AAV2的方法
问：我采用了氯仿纯化AAV2的方法，效果挺好，但是不知道这种方法是否也适用于其它血清型的AAV?您能否给一些这方面的information?
答：这种方法也适用于其它血清型的AAV。

关于三质粒共转染方法制备AAV的问题
问：我现在首次尝试自己包装AAV，使用的是Strategene的AAV Helper Free System。即采用三质粒共转293包装AAV。
1、采用磷酸钙转染，将三质粒共转293，会像腺病毒那样也出现CPE么？大约多长时间会出现呢？出现CPE才能认为是包装成功了么？
2、如果采用脂质体或阳离子为载体进行转染也能成功包装AAV么？Strategene提供的Protocol明确提出不建议使用脂质体，这是什么原因呢？
答： 1、采用磷酸钙方法三质粒共转染293细胞，细胞会有一些变化，但不会像腺病毒那样也出现典型的CPE 。大约在转染后72~84小时收集转染的细胞。开始做的时候，最好用携带EGFP基因的AAV质粒来摸条件，便于观察转染效率，磷酸钙方法转293细胞效率可以达到100% ，至少要有50%以上的转染效率才考虑往下做。
2、如果采用脂质体或阳离子为载体进行转染也能成功包装AAV。但即便是老外也没有这么有钱。Strategene提供的Protocol明确提出不建议使用脂质体，主要原因一是用脂质体的费用太高，无法做比较大的规模（比如做10只15-cm平皿就要用掉1ml脂质体。另外磷酸钙共沉淀转染方法是转染293细胞的最好方法，转染效率极高。
3、磷酸钙试剂和转染的方法十分关键。
4、3个质粒的品质和准确的定量也是一个十分关键的问题。
不少用AAV helper free system 包装AAV病毒的研究者，大多数都感到难以获得足够做动物试验的AAV病毒。需要制备大量高质量的质粒，共转染技术操作需要技术，大量做工作量大，且所获得的AAV的质量差，空壳AAV特别多，用CsCl2超速离心时间很长，多达2天。实际操作不容易。
我们曾经发明过“一株载体细胞/一株辅助病毒”的包装系统，并且取得了很好的效果，尤其是大量制备AAV载体（>10e14 vg)时更能体现其优越性。这个早期的系统转让给了本元正阳公司，他们用这个技术给大家提供有偿服务。
现在北京五加和分子医学研究所(董小岩博士负责)与Xiao Xiao教授合作，也在建立这种国际上通常采用的AAV Helper Free System的三质粒共转染方法，并且取得了一些经验。
北京五加和分子医学研究所现在使用升级后的AAV的包装系统效果更好。

问：我手头有构建好的插入目的基因的rAAV质粒以及aav free system的另外两个质粒pRC和pHelper,想用这个系统包装rAAV病毒,然后进行细胞水平实验,我想用电穿孔方法将三个质粒共转染293细胞,然后包装成病毒,可是问题是我怎么能保证病毒滴度足够以便我下一步的细胞实验呢?好像rAAV是不能象AV一样自我复制以扩增的。
答：你只有大量做，比如做10-100个平皿（15cm直径）293细胞的转染，获得大量AAV，纯化和浓缩，才能得到高滴度足够量的AAV。千万不要把已经做好的AAV拿去“传代”扩增，那会“有去无回，颗粒无收”的。

关于AAV对宿主细胞的基因插入整合问题
问：腺相关病毒载体是不是只要能转入细胞就可以整合到宿主细胞基因组中？如果不是，那么整合率大概有多少？ 是不是跟靶细胞类型有关呢？
答：野生型AAV病毒感染细胞后倾向于整合到19号染色体的AAVS1位点。这个特性是与其rep基因功能和ITR结构以及染色体特定位置的序列相关的．
AAV载体是经过改造的，已经去除了其repcap基因，因此已经失去了特异整合的特性。
对于不同的靶细胞，AAV载体的整合几率是不同的。越来越多的研究发现，在许多组织中AAV载体进入细胞后并不整合，而以附加子（episome）形式存在，最为典型的是在肌肉中。
也有些研究报道AAV载体的整合是相对随机的，有整合到活跃的基因中的倾向。
AAV载体整合问题还不断在研究，感兴趣的战友可以很容易查阅到相关文献。

关于AAV载体的保存和使用的问题
问：AAV载体病毒在摄氏4度环境下能保存多长时间？因为我们是分次使用，在每次使用的反复溶冻对病毒滴度有无太大影响？应用病毒时无菌要求是否非常严格？另外在大鼠脑内目的基因能无限期的持续表达吗？
答：如需要分多次使用,建议放在摄氏4度环境下,放一年半年的都可以，但忌讳反复冻融。
病毒的无菌,对你用于细胞或者动物体内均有一定影响:试想,因为污染了菌,使细胞死了,或者动物细菌感染发热,实验结果是否会受到不利影响呢？
持续表达期限的问题:我的看法是,没有无限期的持续表达这种可能,因为这是永远.能表达多久,确实需要实验结果来回答,不管是你自己做的还是别人的结果。

问：aav不是腺病毒的一种伴随病毒吗？如果没有腺病毒，aav载体携带的基因能很好的表达吗？
答：在应用的时候往往是不加腺病毒的，只是在制备AAV时有的用到腺病毒。没有腺病毒存在下，AAV载体在体内许多租子组织中都能很好地很长期的表达，比如肌肉、神经元、视网膜等。有些血清型的AAV如AAV1在肌肉组织中的表达水平和涉及的肌肉范围高得令人吃惊。

关于病毒载体毒性的问题
问：1.如果我想用病毒载体，有关病毒载体毒性的问题:
会不会把细胞杀死呀？我体外模型用的是人子宫内膜癌细胞（RL95-2）和绒毛膜癌JAR细胞，这两种细胞是不是用腺病毒和逆转录病毒都可以？如果我的体外模型几个小时就可以观察黏附情况，毒性会不会有影响呀？
2.如果用腺病毒的话，腺病毒的免疫反应，还有它的瞬时表达会不会影响到实验结果
3.要过表达，那么病毒载体构建时还用换强启动子或多串几个盒子吗？
4逆转录病毒要求分裂期的细胞，腺病毒多种分化或未分化细胞都可以，其余的对所用的细胞还有什么要求吗？
答：人子宫内膜癌细胞（RL95-2）和绒毛膜癌JAR细胞，这两种细胞用腺病毒和逆转录病毒都可以的，用复制缺陷性腺病毒，MOI不太高（比如高于200）的情况下是没有显著毒性的，、可以设置对照。体外实验，腺病毒的免疫原性体现不出来。

关于慢病毒安全性问题
问：我老板给了一个关于慢病毒基因治疗遗传病的课题，安全性如何？
答：老板是让你做安全性研究还是有效性研究呢？
如果你是问对操作者自身的安全性和对环境的安全性，你可以学习相关的安全性规程，按规程操作和处理废物就可以了。没有什么危险的。

关于病毒载体免疫问题
问：以腺病毒作载体用于基因治疗，注射到新生BALB/c小鼠，诱导免疫耐受，这方面的研究有谁能讲一下吗，比如注射剂量、部位、间隔时间等等。
答：用腺病毒作载体诱导免疫耐受不太合适，因为腺病毒载体本身的免疫原性很强，用作疫苗载体比较好。
诱导免疫耐受用AAV载体，尤其是AAV1载体可能更好。可以参考军科院黎燕教授课题组2005年在J.I.上发表的关于AAV载体介导GAD基因肌肉注射NOD小鼠诱导特异性免疫耐受的文章。

关于腺病毒包装CPE的问题
问：请教几个腺病毒包装的问题
1,CPE是首次包装几天出来？空斑是在CPE出现后才有的吗，大概什么样，有多大？
2,葡萄样改变怎么与细胞密度过大挤上来增殖的相区别？
3,转染前接种密度多少合适，以60mm皿来看？我接种10的6次方，结果到第三四天就密的形成白膜装，即便轻轻换液也容易大片浮起，怎样避免？
4,转染5天浮起的细胞还能产毒吗？
答：1、CPE出现的时间与细胞种类、细胞状态、转染方法和转染效率以及质粒的用量都有关系。我们实验室最快的一次是2.5天出现CPE（即细胞变大、变圆，有脱离瓶壁的趋势，排除细胞处于分裂状态的变圆），5天出现典型的plaque。照片可以请dongxy发给你。一般腺病毒的出毒在7~14天是比较常见的。CPE是指细胞的病变，空斑是CPE的集中体现。空斑的大小肉眼看可以时候针尖或针眼大小。
2、葡萄样改变怎么与细胞密度过大挤上来增殖的相区别：主要看是否细胞变大变肿胀，如果仅仅是过挤，细胞会显得小，而不是变大。
3、转染前细胞50%~80%铺满比较好。60mm皿转染前10（6）细胞比较合适。到第三四天就密的形成白膜状，整块剥落一般是细胞代次过高的表现。浮起的细胞不容易出毒了。
观察细胞病变，需要视野更大一些，能看到周围的细胞情况。另外，你可以用标记笔把认为象空斑病变的地方圈起来，然后动态观察，每8~12小时一次，如果是真的空斑，病变的范围会明显扩大；如果发现它一直没有什么变化，就肯定不是了。

问：腺病毒Adeasy-5系统，包装病毒大概要多少天才发生病变（说明书说7-10天，也有人说20天左右）？用任何一种293细胞都可吗？
答：应该说，没有一定之规。从５天到20 天都是有可能的。细胞好、条件优化得好，出毒就快；否则就慢甚至出不了毒。
用任何一种293细胞都是可以的，其特征是含有腺病毒的Ｅ１区片段。只是其代次不要太高（不超过５０代）。
细胞状态非常重要。如果已经出现容易成片脱落的现象，就不要用了。

关于RCA的问题
问：请问在细菌内同源重组的腺病毒转染293细胞后产生的第一代毒种中 含有RCA的几率有多大，是否其含量一定随扩增增加？为什么我做的结果低代的反而比高代 的容易在HELA细胞上病变？
答：不好说。但一旦产生了RCA，其含量一般是随扩增增加的。你做的结果低代的反而比高代 的容易在HeLa细胞上病变的原因可能有很多，比如2者之间的加入在HeLa细胞的量是否一样。
最为有效的控制RCA的方法是不用293细胞，而采用911细胞、PER.C6细胞或其它的表达腺病毒E1基因的细胞，比如五加和分子医学研究所最近做出的一株基于HeLa细胞的FP.H17细胞能很好地用于E1缺陷的腺病毒的无RCA扩增。

关于腺病毒操作的生物安全问题
问：是否可以在超净台里面操作腺病毒？腺病毒对实验人员有多大危害？
答：一般可以在普通超净台里面操作腺病毒。对实验人员没有什么危害。需要注意几个问题：
1、非复制的腺病毒是比较安全的。复制型的腺病毒则需要更严格一些的条件。
2、携带的基因如果有很明显的毒性，在防护上要更严格一些。
3、在超净台里面操作腺病毒要注意交叉污染问题。防止病毒对培养液、培养器皿、培养的细胞的污染。多个人共用超净台时尤其要注意。
4、今后中国对生物安全的监测会更为严格。要重组一个病毒之前可能要报生物安全委员会的备案。
5、在CDC，腺病毒的操作现在要求在P2实验室中进行。

关于病毒载体安全性问题
问：病毒载体安全性有些问题，不知你对此是怎么看待，不知国内外相关解决方案大概有些什么？比如：免疫原性问题
答：病毒载体的免疫原性各不相同。关键在于如何使用载体，应针对不同疾病选用不同载体。
比如腺病毒载体的免疫原性很强，一般用于治疗肿瘤和用做疫苗载体。这时其免疫原性并不是什么缺点，反而还有好处，起到免疫佐剂的作用。
反转录病毒载体和AAV病毒载体的免疫原性很弱，用于需要长期表达和忌讳引起免疫反应的情况，比如自身免疫性疾病。

关于EGFP的荧光表达的定位信号问题
问：我使用的是PIRES2-EGFP表达载体,会因为PIRES2-EGFP连入的目的基因表达部位不同,转染后绿色荧光的定位就不同吗?还是不会变都与空质粒一样是全细胞表达?
答：是Clontech公司的pIRES2-EGFP质粒吧? 用IRES串联的2个基因可以共表达,但不会"共定位"的。其中的EGFP与空质粒一样是胞浆表达（“全细胞”）表达。
如果你希望EGFP与你插入的基因共定位，可以将你的基因与EGFP基因融合表达。可以采用pEGFP-N1质粒。附件是该质粒的图谱。
问：我做的结果pIRES2-EGFP空质粒是全细胞表达,指的是胞浆和胞核都是绿色.不知道是否正确还是就应胞浆表达?连入我的目的基因后(目的基因应是胞浆表达),可是结果还是胞核胞浆都表达.想问是不是pIRES2-EGFP空质粒就应胞核胞浆都表达,还是应是胞浆表达?
答：pIRES2-EGFP的表达应该在胞浆里,但在光学显微镜下观察,如果不是胞核很大,往往看见整个细胞都是绿色的;因为GFP发出的绿色荧光会"漫"到周围.在有些细胞里可以明显看到在绿色背景下有一个与细胞核轮廓一致的暗区. 用激光共聚焦显微镜下可以更清楚地分辨核区和胞浆区的绿色差别.
问：pIRES2-EGFP的荧光表达有定位信号吗?有人说没有定位信号所以是全细胞.我的实验结果也见到整个细胞都充满绿色。
答：一般的EGFP基因都不带定位信号。除非认为加去的。比如我以前用过加了核定位信号（NLS）的EGFP以及线粒体定位信号的EGFP。这样的EGFP就可以明确定位在核里或线粒体里，后者表现为胞浆中的点状分布的绿色。

关于基因治疗领域的专利问题
问：Lots of patents cover broad areas of gene therapy by foreign companies and institutes, To your best knowledge, what is PI position for Chinese companies like yours and other. What you would do or suggest other to do for enhancing R&D innovation and avoiding patent infringement
答：专利问题的确是一个令人担忧的问题。基因治疗领域中许多核心专利都被国外申请了，尤其是一些新的发明。
不过，在基因治疗领域，专利的保护涉及的层面很多，几乎没有一家公司能拥有一个基因治疗产品的全部专利。而是需要向许多家去license使用权，比如载体、基因元件、改造的部分、生产工艺、纯化方法、制剂、保存甚至方案。
再者，基因治疗药物的研发周期很长，而专利保护的年限也是有限的，最终成为药品上市后的各组成部分的专利状况还很难说。
我的建议是，从现在开始，注意挖掘自己在基因治疗研究工作中的创新点和价值，并及时查新和申请保护。手上握有有价值的东西，就可以在将来和别人进行交换，就可以获得平等对话的权利。如果什么都没有，别人就可以不带你玩了。

关于基因治疗的安全问题
问：After so many up and down events, Safety is still a major issue bothering all regulatory autorities and gene therapy companies worldwide. It should be a top priority for all researchers and regulators.
The first gene therapy product got its birth certificate in China, we are proud of that achievement, however it did not mean we are taking leading position in technology and application, GMP enforcement will be a big challenge for SFDA and the drug maker.
What do you think of the first gene therapy product? Do you favor an easy or tough regulation guideline? What would you predict the real progress and clinical application in near term and long term?
答：很自然，基因治疗的安全问题是这种治疗方法最终被人们接受的关键。本人认为，安全问题要考虑以下几个层面：
1、对个体的安全性
2、对下一代的安全性（遗传安全性）
3、对群体的安全性
4、对环境的安全性
许多医学治疗方法都是经过试验试出来的。基因治疗也需要不断尝试。试验就会有风险。
针对以上层面的安全性问题，个体的安全性问题相比而言是最可以冒风险的。基于此，我们才可能开展临床试验，只有开展临床试验才能知道究竟可行不可行。老鼠不是人，是不会点头的。
关于腺病毒-P53，我想还是看看较大范围的治疗结果如何再说吧。起码到现在还没有严重副作用的报道。大家不要期望值过高才好。it is the first one, not the best one。
审批规则的严格程度也是在实践中不断调整的。规则是用来保证安全的，不是用来限制发展的。

miRNA实验操作流程：
miRNA活性单位为RIF（Relative Inhibited Fold，相对抑制倍数）
1、将细胞培养至细胞总量>10(e)4/孔×孔的数量×2倍时，即可消化细胞、进行细胞计数等准备；
2、直接用单道加样枪或排枪将细胞定量加入到miRNA A-Sensor板（96孔细胞培养板）的各孔中，置于CO2培养箱中，37℃培养；
3、细胞培养 24-48hr后，定量吸取细胞培养上清液至另一块96孔板（未使用过的白色或黑色的96孔板）中，而细胞则先放回至CO2培养箱等待进一步处理；
4、将加入了细胞培养上清液的96孔板，放至96孔荧光检测仪中，仪器将自动完成加酶促反应底物、检测细胞培养上清中的Gluc作用下的荧光强度，获得相应的原始数据（Excel文本格式）；
5、将原始数据使用本公司开发的软件，计算后获得次级数据和图表等实验数据结果。
额外的关注点：
6、如果需要在数天内连续观察细胞的miRNA活性变化，在步骤3后，则应该将细胞置于CO2培养箱中，37℃培养，并依据实验设计在特定的时间点取样检测。此过程需要考虑勿使细胞生长过密及生长状态变差（如果有特殊考虑则另当别论），且需要考虑是否需要每次检测完成后将所培养的细胞做换液处理（弃净原培养液，换新鲜的细胞培养液），这主要依据实验设计：因所检测的Gluc稳定性很好，在一直不换液操作的状态下，细胞的miRNA活性数据为从最开始时的累积效应；而在换液操作的状态下，细胞的miRNA活性数据为单位时间内（换液后至检测时为止）的累积数据，这个区别应该考虑到。
7、如果需要检测某种药物或干预因素对细胞的miRNA活性的影响，则可以在成功完成了步骤3后，将所培养的细胞做换液处理，弃净原培养液，换入含药物的、调配好了浓度的、定量的新鲜细胞培养液，继续细胞培养；依据实验设计在特定的时间点取样检测。该数据可因此设计成药物或干预因素对细胞作用前后自身对照的miRNA活性数据。这样将省时、省钱、省力。
以上操作中步骤，除步骤4和5外均需要无菌操作。

关于慢病毒：

慢病毒载体简介
慢病毒载体（Lentiviral vector, LVs）是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效将目的基因（或RNAi）导入动物和人的原代细胞或细胞系。慢病毒载体基因组是正链RNA，其基因组进入细胞后，在细胞浆中被其自身携带的反转录酶反转为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生RNAi干扰。
慢病毒载体介导的基因表达或RNAi干扰作用持续且稳定，原因是目的基因整合到宿主细胞基因组中，并随细胞基因组的分裂而分裂。另外，慢病毒载体能有效感染并整合到非分裂细胞中。以上特性使慢病毒载体与其它病毒载体相比，比如不整合的腺病毒载体、整合率低的腺相关病毒载体、只整合分裂细胞的传统逆转录病毒载体，有鲜明的特色。大量文献研究表明，慢病毒载体介导的目的基因长期表达的组织或细胞包括脑、肝脏、肌肉、视网膜、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、巨噬细胞等。
慢病毒载体不表达任何HIV-1蛋白，免疫原性低，在注射部位无细胞免疫反应，体液免疫反应也较低，不影响病毒载体的第2次注射（Kafri, T., U. Blomer, D.A. Peterson, F.H. Gage, and I. M. Verma. 1997. Sustained expression of genes delivered directly into liver and muscle by lentiviral vectors. Nat. Genet. 17:314-317）。

慢病毒载体应用：
将目的基因/RNAi基因转入难以转染的细胞，比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞
将目的基因/RNAi基因转入动物组织，以期获得长期表达
构建稳定表达目的蛋白/RNAi的细胞系，再用ex vivo的方法导入动物体内
基因治疗
转基因动物
基因敲除
药物研究：构建表达受体蛋白的细胞系，研究药物的作用
快速建立生产目的蛋白的细胞系，非常有前途的真核细胞表达方法

我们所使用的慢病毒载体系统：
公司所使用的慢病毒载体属于“第三代”慢病毒载体，其基因组的3’ LTR的增强子功能发生了缺失，从而形成了所谓的“自灭活”（Self-inactivation，SIN），即该病毒基因组整合到细胞基因组后，不会产生新的子代病毒，也降低了对周围基因的意外激活，因此具有较好的安全性。病毒的包膜上嵌合了来自水泡口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus）的VSV-G蛋白，使病毒能感染更多种细胞（包括分裂和非分裂细胞），且病毒更趋稳定。（Dull, T., Zufferey, R., et al., A Third-generation Lentivirus Vector with a Conditional Packaging System, J. Virol., 1998, 72,8463-8471）慢病毒载体结构见图1。

HIV-1 genome

与HIV-1相比，慢病毒载体改造包括以下部分：
1、5’ LTR的U3区被RSV的enhancer/promoter取代，3’ LTR的U3区缺失；
2、HIV-1的全部9种蛋白，包括gag、pol、env等从载体基因组中缺失；
3、目的基因由CMV启动子控制，SV40启动子控制抗性基因BSD（Blasticidin）或报告基因EGFP。

包装容量：
野生型HIV-1基因组的长度为10kb，本慢病毒载体的外源基因的插入总长度不能超过6kb（包括Blasticidin的表达盒及目的基因的表达盒），其中目的基因的长度不宜超过4.3kb，否则将影响病毒包装效率。

安全性：
删除了全部HIV-1的编码基因，在介导目的基因的表达时，没有任何HIV-1蛋白的表达；
对5’和3’ LTR分别进行了删除改造，5’LTR缺失U3，换上RSV enhancer/promoter，使载体的复制不再依赖Tat；3’LTR删除U3，使其不再有启动/增强活性，成为自灭活（self-inactivating, SIN）载体；
病毒包装必需的3个蛋白Gag/Pol、Rev、VSV-G（代替HIV-1的Env）分别独立放置在3个质粒上（pGag/Pol、pRev、pVSV-G），且互相之间没有任何同源序列，大大降低了复制型慢病毒（RCL）的产生几率；
与MuLV等逆转录病毒载体相比，慢病毒载体的整合更偏向于宿主细胞基因组的基因表达活跃区，激活沉默的原癌基因的几率可能比逆转录病毒载体低；
慢病毒载体未发现有致肿瘤活性，而MuLV等逆转录病毒载体有致瘤活性（Eugenio Montini, Daniela Cesana, et al., Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration, Nature Biotechnology, 2006, 24:687-696）；
慢病毒的LTR的转录激活能力低于逆转录病毒，激活原癌基因能力也相对较低；
全世界有4千万人感染了HIV-1，发生的整合事件不计其数，但未出现一起致瘤事件；

实验室安全措施 ：
慢病毒载体已经被全世界许多实验室应用，没有出现过任何意外，但仍具有潜在的产生复制型慢病毒（RCL）和致癌的风险，操作者在实验中仍需要保持高度警惕！
所有操作均应尽量在BSL2级生物安全柜中进行，并佩戴一次性口罩和手套，尤其要避免病毒接触口、眼、鼻、耳、伤口等身体开放性区域，避免产生气溶胶，tip头一定要选择带有滤芯的。必须高度注意被污染的尖锐物品，包括针头、注射器、载玻片、移液管、毛细玻璃吸管和解剖刀。每次实验后，立即清理所有接触过病毒的器具，均应高压消毒再进行下一步处理。显微镜台、生物安全柜台面等使用后，用70%乙醇擦拭。意外洒落的含病毒的液体，用卫生纸吸干后，用0.6%次氯酸钠溶液浸泡被污染处1h。装盛慢病毒载体的实验用品，要单独放置，标示清楚，并标注“危险品”字样。尽量使用培养瓶，不要使用培养板来感染病毒，以防意外洒落。对共用实验室的人员进行慢病毒安全培训或提示。

生产流程：
含目的基因的载体质粒pLenti-gene的构建和纯化提取；
pLenti-gene、pGag/Pol、pRev、pVSV-G四质粒共转染293T细胞；
培养48~72h，收集培养上清；
病毒载体的纯化和浓缩（超离和/或超滤）；
分装、-80℃保存；
滴度测定、目的基因检定；
出具检测报告；
干冰运输发货。

保存、使用和运输：
慢病毒载体在-80℃保存6个月，滴度不会明显下降。建议保存6~12个月以上的样品，进行实验前，重新测一次滴度。应尽量避免反复冻融。
使用前从-80℃取出病毒，立即放在37℃水浴锅中，轻轻晃动，使其尽快溶解。用不完的病毒可以暂时放在4℃冰箱中，但最好尽快用完，根据我们的经验，4℃放置1周，滴度会有4~5倍的下降。
对于长距离运输，应先将慢病毒载体保存在-80℃，再采用全程干冰运输，以防滴度下降。

质量控制：
公司对病毒载体的生产一贯采用全程监控的方式，以确保产品质量。您得到慢病毒产品的同时，将同时获得以下质量指标：

载体质粒构建检测
产品无菌检测
滴度检测
物理滴度：p24 ELISA法/或RNA qRT-PCR法
活性滴度：感染293后，GFP荧光FACS计数法/或qPCR法
目的基因的PCR检测
感染和分析
瞬时表达和稳定表达
瞬时表达：本产品感染细胞后，至少要培养24~48小时才能检测目的基因的表达。原因是慢病毒载体的基因组是RNA，需要反转录为DNA，并插入细胞染色体后产能表达。
稳定表达：本产品携带了Blasticidin（一种抗生素基因）的基因，如果用Blasticidin药物进行加压筛选，10~12天后可获得稳定表达目的蛋白的细胞克隆。

感染细胞最佳MOI的测定：
MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒数，通常MOI越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。
对于分裂活跃的细胞，比如Hela、293细胞，MOI=1时，80%以上的细胞均表达目的基因。而对于非分裂细胞，比如原代细胞，感染效率较低。我们建议通过比较不同MOI（比如0、1、5、10、50、100等），选择适合的MOI进行实验（可以考虑选用携带报告基因的病毒，比如Lenti-EGFP）。

感染方法：
按实验需要将细胞铺板（比如24孔板）。细胞数以第2天密度约50%为宜。37℃ 培养过夜。
感染前，从冰箱取出并在37℃水浴中快速融化病毒，用新鲜完全培养基稀释成所需浓度。注意：轻轻混匀，不要使用振荡器。
吸去细胞原有培养基，将稀释好的病毒液加入细胞中。
加入Polybrene（对于293细胞，终浓度6mg/ml，其它细胞可以按注1的方法确定合适的浓度），轻轻摇匀。37℃培养过夜。
感染后第二天，吸去含病毒的培养液，换上新鲜的完全培养液，继续37℃培养。（或感染6小时后换液）
感染后第三天，根据需要，或收集细胞检测目的蛋白的表达，或换上含适当浓度的Blasticidin的新鲜完全培养液，筛选稳定转导的细胞株。
每3~4天换含Blasticidin的完全培养液一次。
换上Blasticidin后10~12天，抗Blasticidin的细胞克隆将形成。
挑选至少5个克隆，进行细胞扩增后，检测目的蛋白的表达。
Blasticidin的浓度筛选方法
一般情况下，2~10mg/ml的Blasticidin足以杀死大部分类型的哺乳动物细胞株。建议用0、2、4、6、8、10mg/ml的Blasticidin培养待测试细胞，每3~4天换液一次，选择10天内杀死所有细胞的最低Blasticidin浓度作为工作浓度。针对293细胞，我们推荐Blasticidin终浓度为6 mg/ml。

注：
Polybrene:（Sigma公司产品，Cat. No. H9268）是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率。Polybrene有一定的细胞毒性，不同细胞对polybrene的敏感度不同，可以用1~10mg/ml的范围筛选合适的浓度，以24h内细胞无明显毒性反应为佳。如果无法找到无细胞毒性的合适浓度，可以不加。通常加入polybrene能提高感染效率2~10倍。配制方法：用无菌去离子水溶解Polybrene，浓度为6mg/ml。过滤除菌，分装成1ml/支。保存在-20℃（可保存1年以上），避免反复冻融3次以上，否则活性受影响。4℃可保存2周。
Blasticidin（Merk Index：12：1350，分子量458.9，分子式：C17H26N8O5- HCl）（10mg/ml储存液）：用无菌去离子水溶解BSD，浓度为5~10mg/ml。过滤除菌，分装成一次用量，保存在-20℃（可保存6~8周），4℃可保存1周。避免反复冻融，不要保存在无霜冰箱中。培养液中的BSD在4℃可保存2周。另外，pH高于7.0会使BSD失活。
常用慢病毒滴度检测方法比较

1 QuickTiter Lentivirus Titer Kit，http://www.cellbiolabs.com/products.php?catID=0004.0006.0003.0000
2 AARON C. LOGAN, et al., Factors Influencing the Titer and Infectivity of Lentiviral Vectors, Human Gene Therapy, 2004, 15:976-988
3 经验值
4 选择的细胞不同，滴度可能会有10倍以上的差异
5 Huszar, D., Ellis, J., and Bernstein, A., A rapid and accurate method for determining the titre of retrovirus vectors lacking a selectable marker. Technique, 1989, 1:28-32.
6 L Sastry, T Johnson, et al., Titering lentiviral vectors : comparison of DNA, RNA and marker expression methods, Gene Therapy, 2002, 9:1155-1162.