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应用于肝脏、肝炎、肝脏肿瘤方面的文章：

恩替卡韦与拉米呋啶在rAAV8-1.3HBV制备的小鼠乙型肝炎病毒感染模型上的比较研究
待发表。 《病毒学报》

用rAAV8-1.3HBV制备不同品系小鼠乙型肝炎病毒感染模型的比较研究
待发表。 《病毒学报》

重组8型腺相关病毒介导双荧光素酶基因在小鼠体内的表达
待发表。《实验和临床病毒学》

高嗜肝性8型重组腺相关病毒体内转导法制备乙型肝炎病毒持续感染小鼠模型
董小岩，尉迟捷，王刚，田文洪，陆月，张风卫，王文，王岳，谭文杰，吴小兵。病毒学报,2010,26(6):424~430。

microRNA-122调控的TK基因有效降低TK/GCV治疗系统的肝毒性
王刚，董小岩，田文洪，尉迟捷，胡键阳，付昕阳，柳云帆，谭文杰，吴小兵。中国肿瘤生物治疗杂志，2010，17（5）：492~498。1 中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所 病毒基因工程国家重点实验室, 北京 100052.2 复旦大学生命科学学院 遗传学研究所 遗传工程国家重点实验室, 上海 200433,3 宁夏医科大学附属医院肝胆外科，银川 750004，开平市中心医院 泌尿外科 广东开平 529300。

利用分泌型荧光素酶体外长期监测小鼠肝脏miRNA活性
王刚，董小岩，胡键阳，田文洪，尉迟捷，王岳，吴小兵。中国科学：生命科学，2011，41（4）：273~280。1 中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所 病毒基因工程国家重点实验室, 北京 100052.2 复旦大学生命科学学院 遗传学研究所 遗传工程国家重点实验室, 上海 200433,3 北京五加和分子医学研究所有限责任公司, 北京 100176. 4 宁夏医科大学附属医院肝胆外科，银川 750004。

A recombinant DNA and vaccinia virus prime-boost regimen induces potent long-term T-cell responses to HCV in BALB/c mice
Deng Y, Zhang K, Tan W, Wang Y, Chen H, Wu X, Ruan L.Vaccine. 2009 Mar 26;27(15):2085-8. Epub 2009 Feb 12.National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Yingxin Street 100, Xuanwu District, Beijing 100052, People's Republic of China.
To explore the best prime-boost regimen and evaluate the T-cellular response memory against HCV, we constructed two DNA vaccine candidates (pVRC-CE1E2 and pAAV-CE1E2) and two recombinant viruses (rTTV-E1E2 and rAAV-E1E2) and then assessed the immune response to different prime-boost patterns in BALB/c mice. The rTTV-E1E2 boosted the immune response to HCV DNA vaccine prime significantly, and the inverted terminal repeat sequence harboring DNA construct PAAV-CE1E2 was the best prime agent in this study. Our study provides new information for both the prime-boost regimen and long-term T-cell response for HCV vaccine development.

三种丙型肝炎包膜感染性假病毒颗粒的制备及初步应用研究 (被引用 5 次)
[期刊论文] 《病毒学报》 ISTIC PKU -2008年4期
张柯，谭文杰，邓瑶，李津，吴小兵，阮力
本研究构建携带HCV代表株H77(1a)、中国HeBei株(1b)以及JFH-1株(2a)丙型肝炎病毒完整的E1-E2包膜糖蛋白基因的表达质粒,间接免疫荧光法及Western blot验证了其在细胞膜(293细胞)上的正确表达.三种包膜质粒分别与慢病毒包...
关键词：丙型肝炎病毒 中和抗体 假病毒

HBV外膜蛋白2型重组腺相关病毒免疫原性 [期刊论文] 《中国公共卫生》 ISTIC PKU -2006年11期
郝晓萌，吴小兵，胡贵方，俞守义
目的 观察乙型肝炎病毒(HBV)外膜大蛋白(LP)基因的2型重组腺相关病毒(rAAV-2-LP)在Balb/c小鼠体内的免疫原性.方法 以5×1011的rAAV-2-LP单次肌肉注射接种Balb/c小鼠,RT-PCR扩增肝脏组织中HBV外膜大蛋白基因cDNA;RIA法检...
关键词：乙型肝炎病毒(HBV) 外膜大蛋白 2型重组腺相关病毒(rAAV-2-LP) 基因表达 细胞毒性T淋巴细胞(CTL)

来源于人外周血单核细胞的树突状细胞感染rAAV-HBsAg后的功能改变 (被引用 9 次)
[期刊论文] 《第一军医大学学报》 ISTIC PKU -2003年7期
胡贵方，吴小兵，俞守义，康禹，侯云德
目的观察人外周血单核细胞来源树突状细胞(DCs)经重组腺相关病毒(rAAV)载体介导乙肝表面抗原(HBsAg)基因感染后的功能改变.方法采用ELSSA试剂盒检测感染rAAV-HBsAg后的DCs(rAAV-HBsAg-DC)分泌IL-12水平以及rAAV-HBsAg-D...
关键词：树突细胞 重组腺相关病毒/免疫学 肝炎表面抗原,乙型 肝炎病毒,乙型

rAAV-2-HBsAg和rAAV-2-GM-CSF共感染增强人外周血单核细胞来源树突状细胞免疫刺激功能
[期刊论文] 《第三军医大学学报》 ISTIC PKU -2004年1期
胡贵方，俞守义，吴小兵，尹芳，陈清，候云德
目的探讨rAAV-2-HBsAg(表达乙肝表面抗原的重组腺相关病毒)和rAAV-2-GM-CSF(表达粒细胞/巨嗜细胞-集落刺激因子的重组腺相关病毒)共感染对人外周血单核细胞来源树突状细胞(DC)免疫刺激功能的影响.方法用rAAV-2-HBsAg和r...
关键词：重组腺相关病毒,Ⅱ型 肝炎表面抗原,乙型 粒细胞/巨嗜细胞-集落刺激因子 树突状细胞 免疫治疗

含乙型肝炎表面抗原基因重组腺相关病毒的构建及其基因的表达和功能初步研究 (被引用 5 次)
[期刊论文] 《第一军医大学学报》 ISTIC PKU -2003年6期
胡贵方，吴小兵，俞守义，董小岩，陈清，候云德
目的构建含乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因的重组腺相关病毒(rAAV)并观察目的基因的表达和功能.方法采用PCR法从PTHBV-1质粒中扩增HBsAg基因(ayw亚型);将PCR扩增产物插入腺相关病毒(AAV)表达质粒pSNAV中,构建重组质粒pSNA...
关键词：肝炎表面抗原,乙型 基因表达 重组腺相关病毒

重组腺相关病毒2型转导人外周血单核细胞来源树突状细胞的研究
[期刊论文] 《病毒学报》 ISTIC PKU -2003年4期
胡贵方，康禹，俞守义，彭建强，马鑫，吴小兵
树突状细胞(dendritic cell,DC)是目前发现的功能最强的专职抗原递呈细胞(antigen presenting cell,APC)，能捕获、加工和提呈抗原,参与淋巴细胞的生长分化,并产生原发性CTL反应的细胞,在激活T细胞介导的免疫反应中起关键...
关键词：

乙型肝炎表面抗原基因重组2型腺相关病毒的免疫原性研究
[期刊论文] 《中国热带医学》 ISTIC -2005年5期
欧程山，胡贵方，陈清，吴小兵，俞守义
目的观察含乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因的2型重组腺相关病毒(rAAV-2-HBsAg)在Balb/c小鼠体内的免疫原性.方法以5×1011的重组病毒颗粒单次注射Balb/c小鼠,RT-PCR扩增肝脏组织中HBsAg基因cDNA:ELISA检测肝组织中HBsAg的表...
关键词：乙型肝炎表面抗原,基因表达 2型重组腺相关病毒,细胞毒性T淋巴细胞活性

 

应用于miRNA等方面的文章：

High-Throughput Functional MicroRNAs Profiling by Recombinant AAV-Based MicroRNA Sensor Arrays
Wenhong Tian1,3#, Xiaoyan Dong2,6#, Xuerong Liu3,4, Gang Wang3, Zheyue Dong2, Wei Shen2, Gang Zheng2, Jianxin Lu4, Jinzhong Chen6, Yue Wang3, Zhijian Wu5*, Xiaobing Wu3*. PLoS ONE 7(1): e29551. doi:10.1371/journal.pone.0029551. 1 College of Life Science, Jilin University, Changchun, Jilin, China, 2 Beijing FivePlus Molecular Medicine Institute, Beijing, China,3 State Key Laboratory for Molecular Virology and Genetic Engineering, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing, China, 4 Wenzhou Medical College, Wenzhou, Zhejiang, China, 5 Unit on Ocular Gene Therapy, National Eye Institute, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, United States of America, 6 State Key Laboratory of Genetic Engineering, Institute of Genetics, School of Life Science, Fudan University, Shanghai, China
Abstract
Background：microRNAs (miRNAs) are small and non-coding RNAs which play critical roles in physiological and pathological processes. A number of methods have been established to detect and quantify miRNA expression. However, method for high-throughput miRNA function detection is still lacking.
Principal Findings：We describe an adeno-associated virus (AAV) vector-based microRNA (miRNA) sensor (Asensor) array for high-throughput functional miRNA profiling. Each Asensor contains a Gaussia luciferase (Gluc) and a firefly luciferase (Fluc) expression cassette to sense functional miRNA and to serve as an internal control respectively. Using this array, we acquired functional profiles of 115 miRNAs for 12 cell lines and found “functional miRNA signatures” for several specific cell lines. The activities of specific miRNAs including the let-7 family, miR-17-92 cluster, miR-221, and miR-222 in HEK 293 cells were compared with their expression levels determined by quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (QRT-PCR). We also demonstrate two other practical applications of the array, including a comparison of the miRNA activity between HEK293 and HEK293T cells and the ability to monitor miRNA activity changes in K562 cells treated with 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA).
Conclusions/Significance： Our approach has potential applications in the identification of cell types, the characterization of biological and pathological processes, and the evaluation of responses to interventions.

Establishment of an AAV Reverse Infection-Based Array.
Xiaoyan Dong1,2., Wenhong Tian3., Gang Wang3, Zheyue Dong2, Wei Shen2, Gang Zheng2, Xiaobing Wu3, Jinglun Xue1, Yue Wang3*, Jinzhong Chen1*. PLoS ONE | www.plosone.org October 2010 | Volume 5 | Issue 10 | e13479. 1 State Key Laboratory of Genetic Engineering, Institute of Genetics, School of Life Science, Fudan University, Shanghai, China, 2 Beijing FivePlus Molecular Medicine Institute, Beijing, China, 3 State Key Laboratory for Molecular Virology and Genetic Engineering, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing, China.
Abstract
Background: The development of a convenient high-throughput gene transduction approach is critical for biological screening. Adeno-associated virus (AAV) vectors are broadly used in gene therapy studies, yet their applications in in vitro high-throughput gene transduction are limited.
Principal Findings: We established an AAV reverse infection (RI)-based method in which cells were transduced by quantified recombinant AAVs (rAAVs) pre-coated onto 96-well plates. The number of pre-coated rAAV particles and number of cells loaded per well, as well as the temperature stability of the rAAVs on the plates, were evaluated. As the first application of this method, six serotypes or hybrid serotypes of rAAVs (AAV1, AAV2, AAV5/5, AAV8, AAV25 m, AAV28 m) were compared for their transduction efficiencies using various cell lines, including BHK21, HEK293, BEAS-2BS, HeLaS3, Huh7, Hepa1-6, and A549. AAV2 and AAV1 displayed high transduction efficiency; thus, they were deemed to be suitable candidate vectors for the RI-based array. We next evaluated the impact of sodium butyrate (NaB) treatment on rAAV vectormediated reporter gene expression and found it was significantly enhanced, suggesting that our system reflected the biological response of target cells to specific treatments.
Conclusions/Significance: Our study provides a novel method for establishing a highly efficient gene transduction array that may be developed into a platform for cell biological assays.

一种利用分泌型荧光素酶基因表达变化监测活细胞中miRNA 活性的新方法
田文洪1*，董小岩1,2,3*，王刚1，吴小兵1. 生物工程学报,2010,26(6):809~816.中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所 病毒基因工程国家重点实验室, 北京 100052.2 复旦大学生命科学学院 遗传学研究所 遗传工程国家重点实验室, 上海 200433, 北京五加和分子医学研究所有限责任公司, 北京 100176.
摘 要: 建立了一种以分泌型的荧光素酶Gluc 为报告基因的miRNA 传感器质粒 (命名为Gsensor) 监测活细胞中miRNA (microRNA) 活性的方法。首先构建了pAAV2neo-Gluc-MCS-polyA 质粒作为Gsensor 的空载体，同时其中的MCS 位点可供插入miRNA 的靶序列。以miR142-3p 为检测对象，将1 个和3 个拷贝的与miR142-3p 完全互补靶序列分别插入pAAV2neo-Gluc-MCS-polyA 中，构建成miR142-3p Gsensor 和miR142-3p Gsensor-3。将它们分别转染至U937细胞中,检测培养上清中Gluc 的表达水平。结果显示二者均可有效反映U937 细胞中miR 142-3p 的抑制活性 (分别与Gsensor 空载体相比)，提示Gsensor 中采用一个拷贝的miRNA 靶序列即可满足检测要求。并且miR142-3p Gsensor也能有效地反映出Anti-miR142 对miR142-3p 活性的抑制作用。随后，分析了时间、转染剂量对Gsensor 检测结果的影响。结果表明，在U937 细胞中miR142-3p Gsensor 表现的miR142-3p 活性在48 h 后趋于稳定；Gsensor 转染剂量在0.001~0.05 pg/cell 范围内不影响其功能。最后，利用miR142-3p Gsensor 检测了HEK293、U937、K562、SP2/0 和P815 细胞内miR142-3p 活性，结果发现miR142-3p 活性在U937、K562、SP2/0 和P815 细胞中均较高，而在HEK293中几乎没有活性。用QRT-PCR 方法检测miR142-3p 的相对拷贝数。结果表明，在HEK293、U937 和K562 细胞中，miR142-3p 活性与其相对拷贝数呈正相关。本研究表明Gsensor 可作为一种有效的miRNA 活性检测工具，为体外实时动态监测miRNA 活性提供了一种新方法。
关键词: miRNA，miRNA 活性，Gsensor，监测

Inhibition of Luciferase expression in mammalian cells by AAV vector plasmid mediated Luciferase shRNA
Ma X, Lu X, Peng J, Tan S, Yuan Z, Yin F, Wang H, Wu X, Hou Y. Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi. 2002 Sep;16(3):253-5.Institute of Virology,Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052, China.
OBJECTIVE: Constructing a plasmid containing the shRNA of luciferase to suppress the expression of luciferase in BHK-21 cell. METHODS: A 334 bp human U6 snRNA promoter was amplified from human genomic DNA by PCR and ligated to a 21 bp reverse repeated motif of luciferase target sequence with 9 bp spacer and AAV plasmid pSNAV. The recombinant pSNAV/U6/Luc plasmid cotransfected with pMAMneoLuc or transfected luciferase cell line to detect the effect of luciferase expression separately. RESULTS: pSNAV/U6/luc suppresses the luciferase expression from pMAMneoLuc by 50% and luciferase cell line by 70%. CONCLUSIONS: The results showed that the short hairpin RNA of luciferase can efficiently suppress its expression in BHK-21.

病毒载体系统的文章：

基于lamda-Red重组酶系统的IVa2基因缺失及重组腺病毒的包装
柳云帆，尉迟捷，王刚，田文洪，陆月，刘雪荣，董小岩，郑刚，沈炜，吴小兵，阮力。病毒学报,2011,27(3):247~264。1 中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所, 北京 100052.2 吉林大学 生命科学学院，长春 130012。3 温州医学院 浙江省医学遗传学重点实验室,4 北京五加和分子医学研究所, 北京 100176.

新型重组AAV5/5 载体及包装系统
董小岩1,2,3*，田文洪1*，袁振华1，谭淑萍1，吴小兵1. 生物工程学报,2010,26(5):679~686. 1 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 病毒基因工程国家重点实验室，北京 100052. 2 复旦大学 生命科学学院 遗传学研究所 遗传工程国家重点实验室，上海 200433. 3 北京五加和分子医学研究所有限公司，北京 100176
摘 要: 本研究组建了一种可用于规模化生产的以重组单纯疱疹病毒为辅助病毒的AAV5/5 载体包装系统。首先，将5型腺相关病毒 (AAV5) 的rep 和cap 基因插入I 型单纯疱疹病毒 (HSV-1) 基因组非必需基因UL2 中，获得重组病毒rHSV1-rep5cap5。其次，构建一种携带AAV5 ITR 的通用型载体质粒pAAV5neo，将报告基因EGFP 插入pAAV5neo 中，得到pAAV5neo-EGFP 质粒。将pAAV5neo-EGFP 质粒导入BHK-21 细胞，用G418 选择培养，挑选出表达EGFP 并在重组病毒rHSV1-rep5cap5 感染下能高效产生rAAV5/5-EGFP 的单克隆载体细胞株C020。用rHSV1-rep5cap5 感染C020细胞制备rAAV5/5-EGFP，用“氯仿处理-聚乙二醇/氯化钠-氯仿抽提”方法粗纯化rAAV5/5-EGFP。用100 kDa 分子量截流超滤方法进一步纯化和浓缩，获得高纯度的rAAV5-EGFP。SDS-PAGE 电泳分析可见3 条特征性外壳蛋白带。电镜分析显示病毒颗粒以实心颗粒为主。用rAAV5/5-EGFP 病毒按1×105 vg/cell 感染体外培养的HEK293 细胞，可见30％细胞呈现绿色荧光。本研究提出了一种高效AAV5/5 载体生产系统和纯化方法，为重组AAV5 载体的进一步应用提供了基础。
关键词: 5 型腺相关病毒 (AAV5)，I 型单纯疱疹病毒 (HSV1)，病毒载体，包装系统

用分泌型荧光素酶报告系统比较TTR启动子与CMV启动子的体内外表达特性
,罗顺涛,田文洪,王刚,董小岩,杨莉,吴小兵.病毒学报,2009,25(6):432~437.四川大学 华西医学院 华西医院 生物治疗国家重点实验室, 成都 610064,中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所 病毒基因工程国家重点实验室, 北京 100052.北京五加和分子医学研究所有限责任公司, 北京 100176.

体外实时动态监测水动力注射分泌型荧光素酶基因的表达
田文洪,王刚,罗顺涛,董小岩,付昕阳,谭文杰,吴小兵..生物工程学报,2009,25(10):1552~1557.中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所 病毒基因工程国家重点实验室, 北京 100052.四川大学 华西医学院 华西医院 生物治疗国家重点实验室, 成都 610064, 北京五加和分子医学研究所有限责任公司, 北京 100176.
为了建立体外实时动态监测转导基因的体内表达, 本研究选择分泌型的荧光素酶基因Gluc作为报告基因, 对其体内外表达特性和检测方法进行了研究。首先构建了Gluc表达质粒pAAV2neo-Gluc。将pAAV2neo-Gluc转染体外培养的Huh7、HepG2细胞后, 细胞培养上清和细胞裂解液中分别检测到Gluc的活性, 而上清比细胞中的含量高约100倍。表明表达的Gluc以分泌形式为主。用水动力法经小鼠尾静脉注射pAAV2neo-Gluc质粒, 活体成像表明Gluc在小鼠体内呈全身分布, 而注射了萤火虫荧光素酶质粒pAAV2neo-Fluc的对照小鼠则主要在肝脏显像。将剂量分别为0.1、1、10、50 μg每只的pAAV2neo-Gluc DNA用水动力法尾静脉注射小鼠, 不同时间点连续尾静脉采血测定其中的Gluc酶活性, 观察其Gluc体内表达和分泌的动态变化。结果显示, 各剂量组的Gluc表达变化规律高度一致: 注射后2 h即可检测到Gluc表达, 10 h后达到高峰, 之后逐渐下降; Gluc的表达水平与注射质粒DNA的量呈正相关; 为了进一步观察Gluc检测的灵敏性, 本研究又比较了注射更低的质粒剂量(包括0.001、0.01和0.1 μg/每只)时Gluc体内表达情况。结果发现注射剂量低至0.001 mg每只小鼠都能在血中检测到Gluc表达, 这一结果提示了Gluc检测的高度灵敏性。本研究首次报道了以Gluc为报告基因体外实时动态监测水动力注射基因的表达规律, 为动态分析水动力注射基因的体内表达调控及功能研究提供了新的有效手段。
We chose Gaussia luciferase (Gluc), a secreted luciferase gene as reporter to real-time detect and dynamically monitor hydrodynamic injection gene expression. First, we constructed an expression vector pAAV2neo-Gluc. Then Huh7 and HepG2 cells were transfected with pAAV2neo-Gluc and the activity of Gluc in the supernatant and cell lysates were assayed. Results showed that the Gluc activity in the supernatant was about 100 higher than that in cell lysates, indicating the expressed Gluc existing mainly as a secreted form as reported. Live bioluminescence imaging of mice hydrodynamic injected pAAV2neo-Gluc showed whole body distribution, while the pAAV2neo-Fluc primarily located in the liver. Then we injected different doses of pAAV2neo-Gluc into mice by tail-vein hydrodynamic injection, took minor amount of blood from mice tails at different time points and measured the luciferase activity to investigate dynamic changes of Gluc expression and secretion in vivo. The results suggested that the time courses of Gluc expression were highly consistent among each dose groups. The luciferase activity in blood could be detected as early as 2 h after injection, reached the peak at about 10 h and gradually decreased from then on. The expression level of Gluc was positively correlated with the dose of injected plasmid DNA. To further detect the assay sensitivity of the ex vivo Gluc measurement method, we investigated three additional groups of mice injected with lower doses of 0.001 μg, 0.01 μg and 0.1 μg pAAV2neo-Gluc respectively. Results revealed that activity of Gluc in blood could be detected even at dose as low as 0.001 μg DNA, suggesting the assay sensitivity was extremely high. In conclusion, a real-time ex vivo detection method of dynamically monitoring of gene expression in vivo by hydrodynamic injection can be a valuable means for the study of gene expression regulation in vivo.

抗AAV2单克隆抗体的制备及特性研究
谭淑萍 袁振华 田文洪 董小岩 吴小兵。病毒学报，2009;25(4):267-273.中国科学院 研究生院 北京 100049，中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所 病毒基因工程国家重点实验室, 北京 100052.复旦大学 生命科学院 遗传学研究所 遗传工程国家重点实验室，上海 200433， 北京五加和分子医学研究所有限责任公司, 北京 100176.

一组可提供AAV载体复制和包装功能的重组HSV-1
Wu Z, Wu X, Hou Y.Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi. 2002 Mar;16(1):74-8.State Laboratory of Molecular Virology and Genetic Engineering, Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052, China.
BACKGROUND: To construct a series of recombinant herpes simplex viruses that can provide replicating and packaging functions for recombinant adeno-associated virus (rAAV), and to select the strains possessing stronger functions for large-scale production of rAAV. METHODS: A set of cosmids that represents the whole genome of HSV-1 was used to generate recombinant HSV-1 expressing rep and cap proteins of AAV-2. An ATG-to-ACG mutation in the start codon of AAV-2 rep protein was generated by site-directed mutagenesis. rep and cap genes, under control of their native promoters, with or without the ATG-to-ACG mutation in the start codon of rep, were inserted into the Xba site of UL2 or UL44 genes, respectively, resulting in the recombinant cosmids cos6-rmc/ UL2, cos56-rc/ UL44 and cos56-rmc/ UL44. Homologous recombination among the HSV-1 fragment on the recombinant cosmids and the rest fragments of HSV-1 genome resulted in three strains of recombinant HSV-1. Together with the one was constructed previously, there were four strains of recombinant HSV-1named HSV1-rc/ UL2, HSV1-rmc/ UL2, HSV1-rc/ UL44 and HSV1-rmc/ UL44 respectively. RESULTS: PCR detection confirmed the existence of rep- gene in the genomes of all four strains of the recombinant HSV-1. Recombinant AAV was produced after infecting the AAV vector cell line that carrying the GFP expression cassette with the four strains of recombinant HSV-1 respectively. However, HSV1-rc/ UL2 and HSV1-rmc/ UL2 produced much more rAAV than HSV1-rc/ UL44 and HSV1c/ UL44 did. CONCLUSIONS: All the four strains of recombinant HSV-1 support rAAV replication and packaging. HSV1 UL2 and HSV1-rmc/ UL2 that provide much stronger functions may be useful for large-scale production of rAAV.
具有AAV载体包装功能的重组HSV的产生
伍志坚 吴小兵 侯云德。科学通报,1999?44(5)?:506-509.中国预防医学科学院病毒学研究所,病毒基因工程国家重点实验室,北京,100052?
腺病毒伴随病毒(AAV)载体有望成为理想的基因治疗载体.常规的共转染法难以大规模制备重组AAV(rAAV),本研究产生了一种具有rAAV包装功能的重组单纯疱疹病毒(rHSV),为rAAV的大规模制备提供了新的思路.采用一套含有1型单纯疱疹病毒(HSV-1)全基因组的粘粒系统(Davison AJ et al, 1993),该系统含有5个粘粒,依次称为cos48, cos28, cos6, cos14和cos56.将AAV的rep和cap基因克隆到粘粒cos6的HSV-1 UL-2基因的XbaⅠ位点上,构建成cos6-rcΔUL2.将cos6-rcΔUL2与其他4个粘粒经PacⅠ酶切后共转染BHK-21细胞,5个粘粒在细胞内发生同源重组而产生携带rep和cap基因的病毒HSV1-rc/ΔUL2.实验结果表明,该重组病毒可稳定传代,并能将瞬时或稳定存在于细胞中的rAAV载体包装成具有感染能力的rAAV.该病毒经改进后,有望以感染载体细胞系的方式实现rAAV的大量生产.
一种快速高效分离和纯化重组腺病毒伴随病毒载体的方法
吴小兵 董小岩 伍志坚 屈建国 侯云德.科学通报?2000,?45 (19 )?2071-2075中国预防医学科学院病毒学研究病毒基因工程国家重点实验室所,北京100052 ,中国预防医学科学院病毒学研究所形态室, 北京100052.
利用2型腺病毒伴随病毒(adeno-associated virus type 2, AAV-2)能够抵抗氯仿的特性, 采用“氯仿处理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提” 3个步骤分离、浓缩和纯化重组腺病毒伴随病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV), 整个纯化过程可在4 h内完成. 最终从5个转瓶生长的4×109个载体生产细胞中可得到5×1013 病毒颗粒/mL, SDS-聚丙烯酰胺凝胶结果表明, rAAV的纯度大于95%, 电子显微镜下绝大多数病毒颗粒的结构完整. 纯化后的rAAV仍保持较强的感染性, 其感染性滴度达到2×1012 转导单位(transducing unit, TU)/mL, 总的病毒颗粒数与感染性病毒颗粒数的比值为25. 为rAAV 大规模生产后的纯化提供了一种简便、快速、低成本的方法.
一种高效快速浓缩腺相关病毒载体的方法
吴小兵 董小岩 伍志坚 屈建国 侯云德.科学通报.2000?45(19):2071-2075.中国预防医学科学院病毒学研究所,病毒基因工程国家重点实验室,北京100052,中国预防医学科学院病毒学研究所,形态室,北京100052
利用2型腺病毒伴随病毒(adeno-associated virus type 2, AAV-2)能够抵抗氯仿的特性, 采用"氯仿处理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提" 3个步骤分离、浓缩和纯化重组腺病毒伴随病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV), 整个纯化过程可在4 h内完成. 最终从5个转瓶生长的4×109个载体生产细胞中可得到5×1013 病毒颗粒/mL, SDS-聚丙烯酰胺凝胶结果表明, rAAV的纯度大于95%, 电子显微镜下绝大多数病毒颗粒的结构完整. 纯化后的rAAV仍保持较强的感染性, 其感染性滴度达到2×1012 转导单位(transducing unit, TU)/mL, 总的病毒颗粒数与感染性病毒颗粒数的比值为25. 为rAAV 大规模生产后的纯化提供了一种简便、快速、低成本的方法.
一种高效的重组腺伴随病毒载体生产系统
Wu Z, Wu X, Cao H, Dong X, Wang H, Hou Y.Sci China C Life Sci. 2002 Feb;45(1):96-104.State Key Laboratory for Molecular Virology and Genetic Engineering, Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, 100052, Beijing, China.
Recombinant adeno-associated virus (rAAV) has proven to be a promising gene delivery vector for human gene therapy. However, its application has been limited by difficulty in obtaining enough quantities of high-titer vector stocks. In this paper, a novel and highly efficient production system for rAAV is described. A recombinant herpes simplex virus type 1 (rHSV-1) designated HSV1-rc/DeltaUL2, which expressed adeno-associated virus type2 (AAV-2) Rep and Cap proteins, was constructed previously. The data confirmed that its functions were to support rAAV replication and packaging, and the generated rAAV was infectious. Meanwhile, an rAAV proviral cell line designated BHK/SG2, which carried the green fluorescent protein (GFP) gene expression cassette, was established by transfecting BHK-21 cells with rAAV vector plasmid pSNAV-2-GFP. Infecting BHK/SG2 with HSV1-rc/DeltaUL2 at an MOI of 0.1 resulted in the optimal yields of rAAV, reaching 250 transducing unit (TU) or 4.28x10(4) particles per cell. Therefore, compared with the conventional transfection method, the yield of rAAV using this "one proviral cell line, one helper virus" strategy was increased by two orders of magnitude. Large-scale production of rAAV can be easily achieved using this strategy and might meet the demands for clinical trials of rAAV-mediated gene therapy.
一种包装 AAV2/ 5 的重组单纯疱疹病毒的构建
连忠辉, 袁振华, 吴小兵.病毒学报.2006,22(4):267-274.中国疾病预防控制中心　病毒病预防控制所　病毒基因工程国家重点实验室,北京　100052 ; 本元正阳基因技术有限公司　863 计划生物领域病毒基因载体研发基地,北京　100176.
为了得到一种可以包装AAV2/ 5 和表达绿色荧光蛋白的重组单纯疱疹病毒,设计并构建了一个由AAV2 rep 基因和AAV5 cap 基因嵌合而成的rep2 cap5 基因,然后,利用一套携带HSV1 基因组的粘粒系统(cos6 、cos28 、 cos14 、cos56 、cos48) ,将rep2 cap5 基因插入cos6 粘粒上HSV1 基因组片段的UL2 基因中,而将EGFP 的表达单位插 入cos56 粘粒上HSV1 基因组片段的UL44 基因中,用这2 个重组粘粒与其它3 个粘粒(cos14 、cos28 、cos48) 共转染 BHK221 细胞获得了重组病毒HSV12r2c52EGFP 并进行了空斑纯化。HSV12r2c52EGFP 病毒能够在BHK221 细胞 连续传代,并且可以观察到几乎所有的感染细胞都能产生绿色荧光。用PCR 方法以及Southern 杂交方法表明所 获得的HSV12r2c52EGFP 中携带有rep2 cap5 基因, 用HSV12r2c52EGFP 感染携带报告基因L acZ 的AAV 载体细 胞株,获得了具有感染性的重组AAV2/ 52LacZ。结果表明,所获得的重组单纯疱疹病毒HSV12r2c52EGFP 可提供 AAV2/ 5 载体包装所需的全部辅助功能,是一种能简便、高效制备重组AAV2/ 5 病毒的通用性辅助病毒。
A novel method for purification of recombinant adeno-associated virus vectors in large-scale
WU Xiaobing, DONG Xiaoyan, WU Zhijian, CAO Hui, NIU Dongbin, QU Jianguo,
WANG Hong & HOU Yunde.Chinese Science Bulletin Vol. 46(6):485-489. State Key Laboratory for Molecular Virology and Genetic Engineering, Beijing 100052, China;
Laboratory of Morphology, Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052, China
A novel method for recombinant adeno-associated virus (rAAV) purification on large scale is described. The method involves three steps, including chloroform treatment, PEG/NaCl precipitation and chloroform extraction. The whole procedure can be performed in four hours. Using this purification method, we can reproducibly obtain, from 4 109 of proviral cells cultured in roller bottles, purified rAAV-GFP stocks with titers of around 5 1013 particles/mL and purity greater than 95%. The infectious
titers of the vector stocks were up to 2 1012 TU/mL, thus particle-to-infectivity rate was about 25. Under an electronic microscope, most rAAV particles appeared full and a few were in intermediate form. Empty particles were rarely seen. The purified rAAV-GFP stocks have been successfully used in in vitro and in vivo transfection experiments. Therefore, this new method offers a simple, rapid and cost-effective way for large-scale rAAV purification.
2型重组腺相关病毒体外转导培养细胞的研究
彭建强,谭淑萍,董小岩,吴小兵。病毒学报，2004;20(2):128-132.

腺病毒载体介导密码子优化型HPV 16 L1基因在哺乳动物细胞中的高效表达及病毒样颗粒的装配 (被引用 4 次)
[期刊论文] 《病毒学报》 ISTIC PKU -2006年2期
周玉柏，周玲，吴小兵，曾毅
为研究重组腺病毒载体作为HPV16预防性疫苗的可行性,构建了含密码子优化型HPV 16 L1基因的重组腺病毒,并对优化基因在哺乳动物细胞中的表达进行研究.首先按照哺乳动物密码子偏好对野生型HPV16 L1基因进行改造并合成优化...
关键词：腺病毒 人乳头瘤病毒16型 密码子优化 病毒样颗粒

仙台病毒BB1株基因组cDNA序列测定及比较分析
杨宇，任鲁风，张辉，侯云德，吴小兵.病毒学报, 2006(2): 96-100.中国疾病预防控制中心 病毒基因工程国家重点实验室,北京100052 中国科学院研究生院,北京100039
该研究对仙台病毒BB1分离株的cDNA全序列进行测序，通过RT-PCR法获得的4个相互重叠的质粒克隆覆盖了全长基因组，并将BB1全长序列与其它已知的仙台病毒序列进行比较。BB1株病毒的基冈组为15384个碱基构成，与其它已知仙台病毒基因组的基因排列与组成规律是一致的，未发现插入或缺失突变。与现已公布5个仙台病毒代表株全基因组序列比较发现，BB1株与其它仙台病毒株同源性均有较大差异。遗传进化分析结果显示，BB1株与Z株和Hamamatsu株的同源性仅为87％和91％，不属于这两株代表的进化分支而归属于第三个基因型。

仙台病毒BB1株6个编码基因的克隆及表达
张海凤 杨宇 董小岩 吴小兵。病毒学报，2009;25(3):213-219.中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所 病毒基因工程国家重点实验室, 北京 100052.中国检验检疫科学研究院，北京，100123, 北京五加和分子医学研究所有限责任公司, 北京 100176.

重组AAV1-Luc病毒制备及体外转导培养细胞的特性 [期刊论文] 《苏州大学学报（医学版）》 ISTIC PKU -2007年5期
彭建强，郭莹，刘征宇，吴小兵，袁振华，曹晖
目的 制备携带萤火虫荧光素酶基因的重组AAV1病毒(rAAV1-Luc),研究该病毒体外转导培养细胞的特性.方法 通过"1株载体细胞/1株辅助病毒"的双因素包装策略制备出rAAV1-Luc,研究该重组病毒体外转导哺乳动物细胞的量效关系,...
关键词：1型重组腺相关病毒 萤火虫荧光素酶基因 转导 基因治疗
重组腺伴随病毒载体介导的hEPO转移及表达
伍志坚 吴小兵 王宏 卢斌 董小岩 侯云德.生物化学与生物物理学报.2002,34(2)：176-180.中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室，北京,100052.
为实现人促红细胞生成素（hEPO）基因在体内的持续表达，构建了携带hEPO的重 组腺伴随病毒（AAV）载体质粒，建立了稳定携带hEPO 表达盒的rAAV-hEPO载体细胞株，采用“一种辅助病毒感染一个载体细胞株”的AAV生产策略，制备并纯化了携带hEPO 的AAV（rAAV-hEPO）。结果表明，AAV介导的hEPO 转移能够使hEPO在培养的BHK-21细胞中得到有效表达；用rAAV-hEPO对Balb/c小鼠进行一次肌肉注射，可使hEPO在小鼠体内持续表达10周以上，并可明显升高小鼠的红细胞 比容。

增强绿色荧光蛋白标记比较腺病毒、腺相关病毒体外转染兔软骨细胞的效果
[期刊论文] 《中华骨科杂志》 ISTIC PKU -2008年5期
翁习生，李连华，邱贵兴，杨新宇，吴小兵
目的 通过增强绿色荧光蛋白(eGFP)标记,比较腺病毒(Ad)、腺相关病毒(AAV)对体外培养软骨细胞的转染效果.方法 体外培养正常3月龄新西兰兔关节软骨细胞,以rAd5-eGFP、rAAV2-eGFP分别转染原代关节软骨细胞,计算最佳传染复数...
关键词：软骨细胞 腺病毒科 转染 Chondrocytes Adenoviridae Transfection

2型重组腺相关病毒体外转导培养细胞的研究 (被引用 4 次)
[期刊论文] 《病毒学报》 ISTIC PKU -2004年2期
彭建强，谭淑萍，董小岩，伍志坚，袁洪，陈方平，吴小兵
为揭示2型重组腺相关病毒感染哺乳动物细胞的一些转导特征,构建并制备了一种携带萤火虫荧光素酶基因的重组2型腺相关病毒rAAV2-Luc,研究了该重组病毒体外转导哺乳动物细胞的量效关系;肝素对转导的拮抗作用;rAAV2的竞争抑...
关键词：2型重组腺相关病毒 萤火虫荧光素酶基因 转导 基因治疗

AAV载体质粒介导的荧光素酶shRNA抑制其在哺乳动物细胞中的表达 (被引用 8 次)
[期刊论文] 《中华实验和临床病毒学杂志》 ISTIC PKU -2002年3期
马鑫，鲁晓春，彭建强，谭淑萍，袁振华，尹芳，王宏，吴小兵，侯云德
目的构建荧光素酶短发夹环产生质粒在BHK-21细胞中抑制荧光素酶的表达. 方法从人基因组DNA中用PCR方法调出人U6 snRNA启动子,接以被9 bp序列间隔的21 bp荧光素酶靶序列的反向重复序列,置于AAV载体质粒pSNAV中,构建成荧光...
关键词：RNA干扰 荧光素酶 短发夹环RNA U6 snRNA启动子

表达绿色荧光蛋白的重组腺病毒伴随病毒的产生
伍志坚吴小兵曹晖牛东滨王宏侯云德。中华实验和临床病毒学杂志。2001，15（3）：300-301.

介导RNAi的tRNAVal启动子质粒载体的建立
[期刊论文] 《中华实验和临床病毒学杂志》 ISTIC PKU -2003年4期
鲁晓春，袁振华，彭建强，马鑫，吴小兵，李小鹰
目的构建以tRNAVal启动子控制shRNA转录引发RNAi的质粒载体. 方法从人基因组中用PCR方法扩增出tRNAVal基因片段,人工突变去除3′末端数个碱基,连以Linker序列,用此经过改造的tRNAVal启动子,构建控制针对荧光素酶的shRNA转...
关键词：RNA干扰 启动区(遗传学) 短发夹样RNA 荧光素酶

一种包装AAV2/5的重组单纯疱疹病毒的构建
[期刊论文] 《病毒学报》 ISTIC PKU -2006年4期
连忠辉，袁振华，吴小兵
为了得到一种可以包装AAV2/5和表达绿色荧光蛋白的重组单纯疱疹病毒,设计并构建了一个由AAV2 rep基因和AAV5 cap基因嵌合而成的rep2cap5基因,然后,利用一套携带HSV1基因组的粘粒系统(cos6、cos28、cos14、cos56、cos48),将r...
关键词：单纯疱疹病毒 腺相关病毒 辅助病毒

一种可切除包装信号的重组1型单纯疱疹病毒的产生
[期刊论文] 《病毒学报》 ISTIC PKU -2000年4期
曹晖，吴小兵，伍志坚，侯云德
单纯疱疹病毒1型(HSV1)能感染几乎所有类型的细胞,尤其具有嗜神经细胞的特点,可经神经细胞的突触顺行或逆行传播,并能在神经元中建立稳定的隐性感染而不影响神经细胞的功能.因此,HSV1可望用作将外源基因导入机体细胞,尤...
关键词：重组单纯疱疹病毒 包装信号 Cre/loxP系统 扩增子病毒载体

HSV-1扩增子病毒载体介导rGDNF的体外表达 (被引用 1 次)
[期刊论文] 《中华实验和临床病毒学杂志》 ISTIC PKU -2000年1期
曹晖，吴小兵，蒋立新

一种携带人α1bIFN的单纯疱疹病毒载体的构建
[期刊论文] 《病毒学报》 ISTIC PKU -2003年3期
马鑫，袁振华，张辉，王宏，吴小兵
为研究用单纯疱疹病毒作为表达细胞因子载体的生物重要性,构建了一种表达人α1b干扰素(IFN)的新型单纯疱疹病毒载体.基于一组含有完整单纯疱疹病毒全基因组的粘粒,α1b IFN表达盒插入到cosmid6上HSV1的UL2基因中,生成cos6...
关键词：重组单纯疱疹病毒 干扰素

应用于神经系统方面的文章：

Intramuscular anti-β-amyloid immunotherapy for AD
Wang Y-J et al.NATURE CLINICAL PRACTICE NEUROLOGY.RESEARCH HIGHLIGHTS.2007.3(11):596-597
Intramuscular delivery of a single chain antibody gene reduces brain Aβ burden in a mouse model of Alzheimer's disease
Yan-Jiang Wang, Anthony Pollard, Jin-Hua Zhong, Xiao-Yan Dong, Xiao-Bing Wu , Hua-Dong Zhou,, Xin-Fu Zhou.Neurobiology of Aging.2007.30(3):364-376.
Department of Human Physiology and Centre for Neuroscience, Flinders University, Adelaide, SA 5042, Australia, Department of Neurology, Chongqing DapingHospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China, State Key Laboratory for Molecular Virology and Genetic Engineering, Institute for Viral Disease Control and Prevention, China Center of Disease Control, Beijing 100052, China,
Anti-β-amyloid (Aβ) immunotherapy has been well documented to effectively elicit amyloid plaque clearance and slow cognitive decline in experimental and clinical studies. However, anti-Aβ immunotherapy was associated with detrimental effects of brain inflammation and microhemorrhage, presumably induced by T-cell-mediated and/or Fc-mediated inflammatory responses. In the present study, a single chain antibody (scFv) against Aβ could effectively inhibit the aggregation of Aβ and promote the disaggregation of preformed Aβ fibrils. The recombined adeno-associated virus vectors carrying the scFv gene were produced to delivery the scFv gene. Hippocampus delivery of the scFv gene was effective in reducing the amyloid plaque in the hippocampus of an Alzheimer’s disease (AD) mouse model. Further studies demonstrated that intramuscular delivery of the scFv gene was as effective as intracranial delivery in reducing the total Aβ level in the brain with a concomitant elevated Aβ level in serum. No enhanced microglial activation, discernable T lymphocyte infiltration, and increased microhemorrhage were found after intracranial and intramuscular delivery of the scFv gene. Our results suggest that intramuscular delivery of the scFv gene would be a novel peripheral noninflammatory immunological modality targeting Aβ clearance and be promising in future drug development for the prevention and treatment of AD.
A novel recombinant adeno-associated virus vaccine reduces behavioral impairment and β-amyloid plaques in a mouse model of Alzheimer’s disease
Zhang J, Wu X, Qin C, Qi J, Ma S, Zhang H, Kong Q, Chen D, Ba D, He W. Neurobiol Dis. 2003 Dec;14(3):365-79.Chinese Academy of Medical Sciences and School of Basic Medicine, Peking Union Medical College, 100005 Beijing, People's Republic of China.
Memory impairment progressing to dementia is the main clinical symptom of Alzheimer's disease (AD). Deposition of the amyloid-beta peptide (Abeta) in brain, particularly its 42-amino acid isoform (Abeta42), has been shown to play a primary and crucial role in the pathogenesis of AD. In this study we have developed a recombinant adeno-associated virus (AAV) vaccine against AD. This vaccine could express CB-Abeta42 (cholera toxin B subunit and Abeta42 fusion protein) in vivo. A single administration of the AAV-CB-Abeta42 vaccine induced a prolonged, strong production of Abeta-specific serum IgG in transgenic mice that overexpressed the London mutant of amyloid precursor protein (APP/V717I), and resulted in improved ability of memory and cognition, decreased Abeta deposition in the brain, and a resultant decrease in plaque-associated astrocytosis. Our results extended the immunological approaches for the treatment and prevention of AD to an oral, intranasal, or intramuscular route that might be better tolerated in human patients than repetitive parental immunizations in the presence of adjuvant. AAV has attracted tremendous interest as a promising vector for gene delivery. Our results raised the possibility that AAV-CB-Abeta42 vector immunization may provide the basis of a novel and promising Alzheimer's disease vaccination program.

Expression of human nerve growth factor β gene in central nervous system mediated by recombinant adeno-associated viruses type-2 vector (被引用 1 次)
[期刊论文] 《中华医学杂志（英文版）》 ISTIC SCI -2004年9期
高凯，吴勇杰，吴小兵，饶春明，王军志
Background Neurone atrophy and loss are major causes of chronic neurodegenerative disorders such as Alzheimer's disease. Despite many pharmacotherapies for neurodegeneration, there are no accepted trea...
关键词：human nerve growth factor β adeno-associated virus gene therapy blood brain barrier

表达分泌型脑源性神经营养因子的腺相关病毒载体的构建及其表达的检测 (被引用 1 次)
[期刊论文] 《生物工程学报》 ISTIC PKU -2008年2期
李惠明，裘玮，王丰，韦芳，陈霞芳，吴小兵，黄倩
采用PCR和体外连接的方法构建了带有信号肽的脑源性神经营养因子(BDNF)的融合基因.将此基因插入到腺相关病毒载体穿梭质粒 pSNAV,然后用重组质粒 pSNAV-Ig-BDNF 转染包装细胞,筛选出永久细胞株后,用携带腺相关病毒rep 及...
关键词：腺相关病毒 脑源性神经营养因子 基因表达 基因治疗

Intramuscular delivery of a single chain antibody gene prevents brain Ab deposition and cognitive impairment in a mouse model of Alzheimer’s disease
Yan-Jiang Wanga,b,*,1, Chang-Yue Gao a,b,1, Miao Yang a, Xiao-Hong Liu a, Yin Sun a, Anthony Pollard a, Xiao-Yan Dong c,d, Xiao-Bing Wuc, Jin-Hua Zhong a, Hua-Dong Zhou b, Xin-Fu Zhou a,** Brain, Behavior, and Immunity, Received 16 February 2010; revised 26 May 2010; accepted 28 May 2010.?Available online 2 June 2010. a Department of Human Physiology, Center for Neuroscience, Flinders University, Adelaide 5042, Australia. b Department of Neurology, Center for Clinical Neuroscience, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China. c State Key Laboratory for Molecular Virology and Genetic Engineering, Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100052, China. d Beijing Fiveplus Molecular Medicine Institute, Beijing 100176, China
Anti-beta-amyloid (Ab) immunotherapy is effective in removing brain Ab, but has shown to be associated with detrimental effects. We have demonstrated that Adeno-associated virus (AAV)-mediated delivery of an anti-Ab single chain antibody (scFv) gene was effective in clearing brain Ab without eliciting any inflammatory side effects in old APPSwe/PS1dE9 transgenic mice. In the present study, we tested the efficacy and safety of intramuscular delivery of the scFv gene in preventing brain Ab deposition. The scFv gene was intramuscularly delivered to APPSwe/PS1dE9 transgenic mice at 3 months of age, prior to Ab deposition in the brain. Six months later, we found that the transgenes were expressed in a stable form at the delivered sites, with a small amount of ectopic expression in the liver and olfactory bulb. Brain Ab plaque formation, Ab accumulation, AD-type pathologies and cognitive impairment were significantly attenuated in scFv-treated APPSwe/PS1dE9 transgenic mice relative to EGFP-treated mice. Intramuscular delivery of scFv gene was well tolerated by the animals, did not cause inflammation or microhemorrhage at the gene expression site and in the brain, and did not induce neutralizing antibodies in the animals. These findings suggest that peripheral application of scFv is effective and safe in preventing the development of Alzheimer’s disease (AD), and would be a promising non-inflammatory immunological modality.

Construction and expression of recombinant adeno-associated virus expressing brain-derived neurotrophic factor
Li H, Qiu W, Wang F, Wei F, Chen X, Wu X, Huang Q.Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 2008 Feb;24(2):328-32.Central Laboratory, First People's Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200080, China.
A fusion gene called Ig-BDNF, in which brain-derived neurotrophic factor cDNA fused to the 3' end of signal peptide of Ig coding sequence, was constructed by PCR, digested and subcloned into shuttle plasmid pSNAV to obtain a recombinant plasmid pSNAV-Ig-BDNF. Then the plasmid encoding fusion protein was transfected into 293 cell lines and the stably transfected clones were selected with neomycin. AAV1 containing Ig-BDNF fusion gene vectors were obtained by super-infection by Herpes virus. The resultant adeno-associated virus vectors AAV-Ig-BDNF were confirmed by PCR, Western blotting and a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) after infection of 293 cell lines. The results indicated that AAV-Ig-BDNF contained the target gene, and infected cells and produced the fusion protein into the supernatant. The content of BDNF in medium per 5x104 cells over a 24 h incubation period reached 1000 pg/mL. With the help of non-replicative adenovirus during AAV-Ig-BDNF infection, the expression of BDNF increased 7-8 fold, and the enhancement of BDNF gene expression was observed in a concentration-dependent manner. These results suggested that a functional AAV-Ig-BDNF was successfully constructed and it offers basis for further study for gene therapy of neural degeneration diseases.

单纯疱疹病毒Ⅰ型扩增子载体转移脑啡肽基因在神经细胞的表达 (被引用 5 次)
[期刊论文] 《中华麻醉学杂志》 ISTIC PKU -2002年4期
王锷，郭曲练，曹晖，吴小兵，毕好生，白念岳，王云姣
目的研究采用单纯疱疹病毒I型扩增子载体将脑啡肽基因导入神经细胞,观察载体lacZ基因和外源脑啡肽基因的表达.方法实验共分4组:A组为对照组,未加病毒悬液的神经细胞;B组,加病毒悬液的神经细胞培养2d;C组,加病毒悬液的神...
关键词：疱疹病素Ⅰ型,人 脑啡肽类 基因表达调控,病毒 神经元

表达脑啡肽基因的单纯疱疹病毒Ⅰ型扩增子载体的构建、包装和扩增 (被引用 4 次)
[期刊论文] 《中华麻醉学杂志》 ISTIC PKU -2001年12期
王锷，郭曲练，曹晖，吴小兵，毕好生，白念岳，程智刚
目的对单纯疱疹病毒Ⅰ型扩增子质粒装载脑啡肽基因,并进行包装和扩增后,评价其在疼痛的转基因治疗上的作用.方法将pCMVHPPE质粒中的人前脑啡肽原基因插入单纯疱疹病毒Ⅰ型扩增子质粒pHSVIRESlacZ,再用单纯疱疹病毒温敏株辅...
关键词：疱疹病毒Ⅰ型,人 脑啡肽类 基因表达调控,病毒

rAAV-hGDNF对谷氨酸钠诱导原代培养大鼠胚胎脊髓神经元损伤的保护作用 (被引用 2 次)
[期刊论文] 《解剖学报》 ISTIC PKU -2002年5期
焦建伟，高扬，田竟生，吴小兵，伍志坚，林嘉友
目的探讨rAAV-hGDNF对谷氨酸钠诱导的大鼠脊髓神经元死亡的保护作用. 方法建立谷氨酸钠诱导体外培养大鼠脊髓神经元损伤模型,用自行包装的rAAV-hGDNF病毒感染原代培养大鼠脊髓神经元,经双醋酸荧光素和碘化丙啶法辨认存活...
关键词：胶质细胞源性神经营养因子 腺病毒相关病毒 脊髓神经元 一氧化氮合酶

CT引导脑内植入携带人类酪氨酸羟化酶基因腺相关病毒载体治疗实验性帕金森病猴
[期刊论文] 《中华放射学杂志》 ISTIC PKU -2003年11期
王维，毛俊，于小平，刘晟，胡维新，曾赵军，蔡维军，吴小兵
目的观察CT引导脑内注射人类酪氨酸羟化酶基因腺相关病毒载体(AAV-hTH)对神经细胞的转染能力,以及对帕金森病(PD)猴的治疗效应.方法经右侧颈内动脉注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)制作6只偏侧帕金森病恒河猴模...
关键词：帕金森病 腺相关病毒 酪氨酸单氧化酶 基因疗法 猕猴属

 

 

应用于肿瘤方面的文章：

腺病毒提高腺相关病毒在耐药与非耐药肿瘤细胞中的基因表达及其机制 [期刊论文] 《中国肿瘤生物治疗杂志》 ISTIC PKU -2007年5期
张圣海，吴继红，董小岩，吴小兵，田毓华，刘新建，黄倩
目的: 研究利用低剂量腺病毒提高重组腺相关病毒2型(recombined adeno-associated virus,rAAV2)在耐药与非耐药肿瘤细胞中基因表达水平的新方法,并初步探讨其可能的作用机制.方法: rAAV2-GFP单独或联合复制缺陷型腺病毒...
关键词：重组腺相关病毒 复制缺陷型腺病毒 条件复制型腺病毒 肿瘤细胞 基因表达

利用腺病毒提高腺相关病毒对肿瘤细胞的转导效率 [期刊论文] 《中华医学杂志》 ISTIC PKU -2007年28期
李惠明，王丰，韦芳，董小岩，王慧萍，裘玮，张巨峰，陈霞芳，吴小兵，黄倩
目的 探讨小量腺病毒作为辅助病毒能否增强腺相关病毒(AAV)对肿瘤细胞和裸鼠肿瘤模型的转导效率并对增强的机理进行初步探讨.方法 采用绿色荧光蛋白(EGFP)标记的AAV2联合不同滴度的非复制型腺病毒(Ad-null)感染人非小细...
关键词：肿瘤 基因疗法 腺病毒,人 腺相关病毒 转导

腺相关病毒载体介导的人内皮抑素的体外表达及对内皮细胞抑制作用的研究 (被引用 12 次)
[期刊论文] 《病毒学报》 ISTIC PKU -2002年3期
高雪军，伍志坚，吴小兵，封多佳，侯云德
抗血管生成基因治疗是一有希望的抑制肿瘤生长及转移的方法.在实验中构建了含有人内皮抑素(endostatin)基因的重组腺相关病毒载体rAAV-hE.所包装纯化的重组病毒滴度达0.5×1012v.g./ml.rAAV-hE能有效感染培养细胞,EIA法检...
关键词：腺相关病毒载体 抗血管生成 内皮抑素 肿瘤 基因治疗

Toxicology profiles of a novel p53-armed replication-competent oncolytic adenovirus in rodents, felids, and nonhuman primates
Su C, Cao H, Tan S, Huang Y, Jia X, Jiang L, Wang K, Chen Y, Long J, Liu X, Wu M, Wu X, Qian Q. Toxicol Sci. 2008 Nov;106(1):242-50. Epub 2008 Aug 14.Laboratory of Viral and Gene Therapy, Eastern Hepatobiliary Surgical Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200438, China.
Conditionally replicating adenovirus (CRAd) has demonstrated to be safe in clinical studies. We generated a triple-regulated p53-armed CRAd, SG600-p53, in which the partially deleted E1a and E1b genes are regulated under the human telomerase reverse transcriptase promoter and the hypoxia response element. SG600-p53 was proven to be effective both in vitro and in vivo. In this study, the preclinical safety profiles of SG600-p53 in animal models were investigated. SG600-p53 had no adverse effects on mouse behavioral and nervous systems at 1.0 x 10(11) viral particles (VP)/kg, 2.0 x 10(11) VP/kg and 4.0 x 10(11) VP/kg doses, and on cat cardiovascular and respiratory systems at 2.0 x 10(10) VP/kg, 4.0 x 10(10) VP/kg, and 8.0 x 10(10) VP/kg doses. In acute toxicity test in mice, the maximum tolerated dose (2.5 x 10(13) VP/kg) induced cachexia, decreased activity, and eye closure in 9/20 mice which could be self-resolved within 30 min. Sensitized by five repeated ip injections at 1.0 x 10(10) VP/kg each ip and excitated by one iv injection at 1.0 x 10(11) VP/kg, guinea pigs did not show any sign of systemic anaphylaxis. In repeat-dose toxicological studies, the no-observable-adverse-effect levels of SG600-p53 in rats (1.0 x 10(11) VP/kg) and cynomolgus monkeys (5.0 x 10(11) VP/kg) were 12-fold and 60-fold of the proposed clinical dose, respectively. Intramuscular injections of SG600-p53 in cynomolgus monkeys caused inflammation at injection sites, which was alleviative at the end of observation period. The anti-virus antibody was produced in animal sera and decreased gradually 4 weeks later. No histopathological changes were found by bone marrow examination. Our data in different animal models suggest that SG600-p53 is a safe antitumor therapeutic agent.
A novel triple-regulated oncolytic adenovirus carrying p53 gene exerts potent antitumor efficacy on common human solid cancers
Wang X, Su C, Cao H, Li K, Chen J, Jiang L, Zhang Q, Wu X, Jia X, Liu Y, Wang W, Liu X, Wu M, Qian Q. Mol Cancer Ther. 2008 Jun;7(6):1598-603.Laboratory of Viral and Gene Therapy, Eastern Hepatobiliary Surgical Hospital, Second Military Medical University, 225 Changhai Road, Shanghai 200438, People's Republic of China.
Conditionally replicating adenoviruses (CRAd) can replicate specifically in cancer cells and lyse them. The CRAds were widely used in the preclinical and clinical studies of cancer therapy. We hypothesize that more precisely regulated replication of CRAds may further improve the vector safety profile and enhance its antitumor efficacy. Here, a triple-regulated CRAd carrying p53 gene expression cassette, SG600-p53, was engineered. In SG600-p53, the E1a gene with a deletion of 24 nucleotides within CR2 region is controlled under the human telomerase reverse transcriptase (hTERT) promoter, the E1b gene expression is directed by the hypoxia response element (HRE), whereas the p53 gene is controlled by the cytomegalovirus promoter. The precise triple-regulation endows SG600-p53 with enhanced antitumor potential and improved safety profile. The tumor-selective replication of this virus and its antitumor efficacy were characterized in several tumor cell lines in vitro and in xenograft models of human non-small cell lung cancer in nude mice. With the selective replication and oncolysis, it was found by ELISA assay that SG600-p53 expressed p53 efficiently in cancer cells. In NCI-H1299 tumor xenograft models, SG600-p53 displayed a tumor-selective killing capacity. At a dose of 2 x 10(9) plaque-forming units, SG600-p53 could completely inhibit the tumor growth and more effective than replication-defective Ad-p53. Histopathologic examination revealed that SG600-p53 administration resulted in cancer cell apoptosis. We concluded that the triple-regulated SG600-p53, as a more potent and safer antitumor therapeutic, could provide a new strategy for cancer biotherapy.

AD5/F35腺病毒载体对不同来源造血系统恶性细胞转染效率的研究
王凯,彭建强,袁振华,吴小兵.中国实验血液学杂志, 2006(3): 525-528.长沙湘雅医院血液科,长沙410008 长沙湘雅第三医院中心实验室,长沙410013 国家863病毒载体研究发展基地,北京100176.
本研究比较AD5/F35腺病毒载体对不同来源的血液系统恶性细胞系感染效率的差异和细胞毒性反应.用AD5/F35-EGFP以不同MOI（感染复数）感染不同来源的血液恶性细胞系并用AD5-EGFP作为对照;用流式细胞术检测荧光阳性细胞比例,进行荧光显微镜照相并用MTT法检测病毒对感染靶细胞的杀伤作用.结果表明：对于髓系来源的细胞在MOI为30时,AD5/F35载体的感染效率大于99%,AD5载体在MOI为1000时感染效率为26.4%;对于B系来源的细胞在MOI为1 000时,AD5/F35载体感染效率为11.7%,AD5载体为5.7%;AD5/F35和AD5载体都不能有效地感染T系来源细胞,在MOI达到1000也未检测到荧光阳性细胞.在MOI为1 000的情况下AD5/F35载体对感染靶细胞也无明显杀伤作用.结论：AD5/F35载体对不同来源的血液恶性细胞的感染具有一定的选择性,对髓系来源细胞感染能力强,对B系来源细胞有一定感染能力,而且对感染靶细胞毒性小.AD5/F35载体优于常用的5型腺病毒载体,在以髓系细胞为靶细胞的基因治疗中有着较好的应用前景.

重组腺相关病毒载体介导人血管抑素K1-5基因预防和治疗B16黑素瘤的实验研究 (被引用 1 次)
[期刊论文] 《肿瘤》 ISTIC PKU -2006年5期
曹培国，吴小兵，阳月新，黄程辉，龙林，沈守荣
目的:研究重组腺相关病毒载体介导人血管抑素K1-5基因(rAAV-AG)对B16F0恶性黑素瘤细胞生长的影响.方法:观察rAAV-AG单次肌肉注射在预防肿瘤生长、血行转移及治疗肿瘤方面的不同作用;Western blot法定性检测血管抑素表达情...
关键词：黑素瘤,实验性 血管抑制素类 腺病毒科 基因疗法

腺病毒载体介导的RNAi对SK-BR-3细胞c-Met表达的影响
[期刊论文] 《解剖学杂志》 ISTIC PKU -2006年5期
赵慧，陈东，袁振华，王忠山，吴小兵
目的:通过腺病毒载体介导的RNA干扰技术抑制乳腺癌细胞HGF受体c-Met的表达,抑制乳腺癌细胞增殖、诱导细胞凋亡.方法:PCR法获得人U6启动子及带有c-Met反向互补靶序列的片段HU6shmet;利用腺病毒载体将其传递至SK-BR-3细胞;...
关键词：c-Met肝细胞生长因子 腺病毒 RNA干扰

鼻咽癌治疗和预防性疫苗
[期刊论文] 《中国科技成果》 -2008年5期
周玲，李德锐，王琦，左建民，贾俊岭，叶树清，李红霞，陈志坚，陈炯玉，张锦堃，吴小兵，曾毅
国家863计划 "鼻咽癌治疗和预防性疫苗的研究"课题,研制含有EB病毒潜伏膜蛋白1.2(EBV-LMP1.2)的重组腺病毒(Ad-LMP1,2)疫苗,应用于鼻咽癌(NPC)患者放疗和/或化疗后,提高其EB病毒特异性细胞免疫,以阻断NPC的复发和转移(...
关键词：

腺相关病毒载体介导变异体DHFR和GFP融合基因入人外周血干祖细胞的实验研究
[会议论文] 2007 - 2007亚太国际肿瘤生物学和医学学术会议暨首届解放军总医院肿瘤综合防治高峰论坛及第二届中国中青年肿瘤专家论坛
李黎波，冯茹，杨仪，董青，成军，吴小兵，
目的：以腺相关病毒(AAV)为载体，将双突变的二氢叶酸还原酶(mDHFR)和绿色荧光蛋白(GFP)融合基因导入外周血造血干细胞，达到保护机体造血功能的目的，同时建立一个简便、易行的检测目的基因的体系。 方法：构建携带人mDHF...
关键词：肿瘤化疗 造血保护 腺相关病毒 变异体二氢叶酸还原酶 绿色荧光蛋白 基因转染 外周血干祖细胞

携带人血管抑制因子K1-5基因的腺相关病毒载体的构建及其对血管内皮细胞的抑制作用 (被引用 1 次)
[期刊论文] 《中国生物制品学杂志》 ISTIC -2005年3期
高雪军，伍志坚，封多佳，吴小兵，侯云德
目的构建含人血管抑制因子K1-5基因的重组腺相关病毒载体rAAV-K5,研究其在体外表达及对血管内皮细胞的抑制作用.方法将K1-5基因插入通用型AAV载体质粒pSNAV中,构建重组质粒pSNAV-K5.用pSNAV-K5转染BHK-21细胞,经G418选择...
关键词：人血管抑制因子K1-5 腺相关病毒载体 基因治疗 肿瘤

重组腺相关病毒介导人内皮抑素抑瘤作用的实验研究 (被引用 2 次)
[期刊论文] 《癌症》 ISTIC PKU -2002年12期
路国秋，查园园，吴小兵，杨建国，张雪艳，付明，梁肖，吴旻，林晨
背景与目的:研究表明,内皮抑素能抑制肿瘤血管的生成,进而抑制肿瘤的生长和转移,然而有关内皮抑素治疗的研究报道却很少.本研究初步探讨了重组腺相关病毒介导内皮抑素对肿瘤生长和转移的作用.方法:用RT-PCR方法获得人内...
关键词：重组腺相关病毒 内皮抑素 肿瘤 基因治疗

重组腺伴随病毒载体表达人白细胞介素12的研究 (被引用 1 次)
[期刊论文] 《病毒学报》 ISTIC PKU -2002年1期
郝晓萌，吴小兵，伍志坚，舒斯云，侯云德
白细胞介素12(IL-12)具有广谱抗肿瘤、抗感染的作用,是由两个亚单位40kD(p40)和35kD(p35)通过二硫键构成的杂合体,有可能通过分别表达亚单位的方式来表达有功能活性的IL-12.该实验尝试利用重组腺伴随病毒(rAAV)载体进行人...
关键词：人白细胞介素12 重组腺伴随病毒 载体 基因治疗

AD5/F35腺病毒载体对不同来源造血系统恶性细胞转染效率的研究 (被引用 5 次)
[期刊论文] 《中国实验血液学杂志》 ISTIC -2006年3期
王凯，彭建强袁，振华，吴小兵
本研究比较AD5/F35腺病毒载体对不同来源的血液系统恶性细胞系感染效率的差异和细胞毒性反应.用AD5/F35-EGFP以不同MOI(感染复数)感染不同来源的血液恶性细胞系并用AD5-EGFP作为对照;用流式细胞术检测荧光阳性细胞比例,...
关键词：AD5/F35型腺病毒载体 AD5型腺病毒载体 感染效率 细胞毒作用 造血系统肿瘤细胞

腺相关病毒与变异体DHFR和GFP重组载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达
[期刊论文] 《中国肿瘤生物治疗杂志》 ISTIC PKU -2003年4期
李黎波，罗荣城，冯茹，董青，成军，吴小兵
全身化疗仍然是目前治疗恶性肿瘤的主要手段之一,而化疗对骨髓造血的抑制严重影响治疗肿瘤的疗效.将耐药基因导入造血干细胞可以保护机体的造血,从而提高对化疗敏感肿瘤患者对化疗药物的耐受性,增大化疗药物的剂量,缩短...
关键词：腺相关病毒 变异体二氢叶酸还原酶 绿色荧光蛋白 基因转染

 

应用于眼科方面的文章：

Distinctive Gene Transduction Efficiencies of Commonly Used Viral Vectors in the Retina
Sheng-Hai Zhang， Ji-Hong Wu，Xiaobing Wu, Xiaoyan Dong,Xin-Jian Liu, Chuan-Yuan Li,Qian-Huang. Current Eye Research, 2008.33:81–90。Experimental Research Center, No.1 People’s Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai, China,The State Key Laboratory of Molecular Virology and Gene Engineering, Chinese Academy of Preventive Medical Sciences, Beijing 100050, Experimental Research Center, No.1 People’s Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai, China,Department of Radiation Oncology, University of Colorado Health Sciences Center, Aurora, Colorado, USA.
The transduction efficiency and cell tropism of viral vectors rAAV2/1, rAAV2, Ad5, Ad5/F35, and Lentivirus were evaluated in retina. All viral vectors achieved efficient transduction in living rat retina. However, each vector showed distinctive efficiency in vitro especially for rAAV2/1, which displayed poor transduction in cultured retinal cells. Distinctive cell-specific GFP expression was observed in vivo and in vitro for the same viral vector. The cellspecific tropism was not strictly correlated with the correspondent distribution of viral receptors in retina. These results provided important insights into the selection of appropriate vectors when specific retinal diseases are considered for gene therapy.
Enhanced transduction and improved photoreceptor survival of retinal degeneration by the combinatorial use of rAAV2 with a lower dose of adenovirus
Wu J, Zhang S, Wu X, Dong X, Xu P, Liu X, Li C, Huang Q.Vision Res. 2008 Jul;48(15):1648-54. Epub 2008 May 29.Experimental Research Center, EYE & ENT Hospital of Fudan University, Shanghai, China.
Recombinant adeno-associated virus (rAAV) is widely used in retinal gene therapy. Enhanced rAAV transduction may be important for better therapeutic effects in some retinal gene therapies. In this study, we examined the effects of adenovirus 5 (Ad5) on retina transduction mediated by rAAV2. Our results provide the first evidence that low levels of either replication-incompetent or conditional replication-competent Ad5 significantly enhance and accelerate transgene expression in human and rat retinal cells. This effect occurs principally at the transcriptional level, rather than through enhanced viral entry or DNA replication. In in vivo analyses with the SD rat, the Balb/c mouse, and the RCS rat, strong enhancement and acceleration of transgene expression, as well as therapeutic effects, were confirmed. Low levels of Ad5 may enhance the utility of rAAV2-mediated transduction strategies in future clinical investigations.
vascular diseases.

1型及2型腺相关病毒对视网膜细胞转导效率的比较研究 (被引用 2 次)
[期刊论文] 《中华医学杂志》 ISTIC PKU -2006年40期
吴继红，张圣海，刘焰，陈霞芳，徐萍，吴小兵，黄倩
目的 探讨不同血清型的重组腺相关病毒(rAAV)对视网膜细胞的转导效率、基因表达水平以及感染细胞类型的差异,为眼底病基因治疗选择适当的载体提供实验依据.方法 采用携带绿色荧光蛋白报告基因的血清型1型(rAAV2/1-EGFP)和...
关键词：腺病毒科 视网膜 转导效率

AAV载体介导的视网膜基因转移实验研究 (被引用 8 次)
[期刊论文] 《眼科新进展》 ISTIC PKU -2001年4期
单清，张杰，任华，王登龙，伊洪涛，吴小兵，钱焕文
目的以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)作为标记基因,观察腺相关病毒(AAV)载体介导视网膜基因转移作用,为视网膜疾病的基因治疗打下基础.方法制备重组腺相关病毒rAAV-gfp;将纯化的rAAV-gfp病毒10μL (10×1...
关键词：视网膜 基因转移 腺相关病毒载体 绿色荧光蛋白

 

 

应用于类风湿性关节炎等方面的文章：

可溶性肿瘤坏死因子受体II-脂联素球部融合蛋白的真核表达及生物学活性检测
陈素云1,2，何秋山3，董小岩2,4，吴小兵2，高基民1,3 生物工程学报,2010,26(2): 207-215. 1 温州医学院 浙江省医学遗传学重点实验室，温州 325035. 2 中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所 病毒基因工程国家重点实验室，北京 100052. 3 南方医科大学生物技术学院，广州 510515. 4 北京五加和分子医学研究有限公司，北京 100176
摘 要: 本研究设计和构建了一种人肿瘤坏死因子受体II 胞外区与人脂联素球部的融合基因sTNFRII-gAD，且相应的融合蛋白在哺乳动物细胞BHK-21S 的无血清培养体系中实现了表达，并对该融合蛋白进行了初步鉴定。首先，用RT-PCR方法从人的外周血淋巴细胞总RNA 中扩增人肿瘤坏死因子II 型受体胞外区基因片段，与脂联素球部基因片段融合，克隆至pAAV2neo 表达载体中，构建成pAAV2neo-sTNFRII-gAD。随后，用pAAV2neo-sTNFRII-gAD 转染BHK-21S 细胞获得G418 抗性细胞BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRII-gAD；然后，将原来含有血清的培养液换成无血清的化学成分限定的培养液，细胞从贴壁培养方式转换成悬浮培养方式；最后，收集BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRII-gAD 无血清悬浮培养24 h 后的培养上清， 进行sTNFRII-gAD 融合蛋白的鉴定分析。酶切鉴定和测序结果显示， 所构建的pAAV2neo-sTNFRII-gAD 质粒结构正确，sTNFRII-gAD 序列与预期一致；分别用抗人肿瘤坏死因子受体II 和抗人脂联素球部的单克隆抗体检测pAAV2neo-sTNFRII-gAD 瞬时转染的BHK-21S 细胞，免疫荧光呈现阳性；免疫印迹分析在pAAV2neo-sTNFRII-gAD 稳定转染的BHK-21S 细胞上清中检测到sTNFRII-gAD 融合蛋白的表达，并以单体、三聚体和三聚体以上的多聚体形式存在。活性测定结果表明，sTNFRII-gAD 融合蛋白具有显著抑制TNFα 杀伤L929 细胞的活性。因此，本研究为下一步大量制备sTNFRII-gAD 融合蛋白用于体内外功能研究提供了良好基础。
关键词: 肿瘤坏死因子α 拮抗剂，可溶性肿瘤坏死因子受体II，脂联素，融合蛋白，真核表达

腺病毒载体介导的重组蛋白sTNFRⅡ-gAD快速表达和制备 [期刊论文] 《生物工程学报》 ISTIC PKU -2011年8期
陆月，刘丹，张孝任，刘雪荣，沈炜，郑刚，柳云帆，董小岩，吴小兵，高基民
利用腺病毒载体高效感染哺乳动物细胞及表达外源基因的特性,建立一种快速高效表达及制备重组蛋白的方法,并用该方法获得sTNFRⅡ-gAD(可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ-脂联素球部融合蛋白)蛋白纯品.首先用携带EGFP基因的腺病毒载...
关键词：腺病毒 重组蛋白 BHK21细胞 哺乳动物细胞 sTNFRⅡ-gAD

重组腺相关病毒2型/人肿瘤坏死因子受体:Fc(rAAV2/hTNFR:Fc)的构建和生物学活性研究 (被引用 1 次)
[期刊论文] 《病毒学报》 ISTIC PKU -2005年3期
高凯，赵爱志，吴小兵，药力波，张英起，王军志
为研究腺相关病毒2型载体应用于类风湿性关节炎进行基因治疗的可行性,首先构建携带人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和人免疫球蛋白IgG1 Fc段融合基因的重组2型腺相关病毒(FAAV2/hTNFR:Fc),并对其生物学活性进行研究.以RT-P...
关键词：腺相关病毒 基因治疗 肿瘤坏死因子 生物学活性 类风湿性关节炎

重组腺相关病毒Ⅰ型/大鼠肿瘤坏死因子受体:Fc(rAAVⅠ/ratTNFR:Fc)的构建和在大鼠体内表达的初步研究
[期刊论文] 《苏州大学学报（医学版）》 ISTIC PKU -2005年2期
高凯，赵爱志，吴小兵，药力波，张英起，王军志
目的构建携带大鼠肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和大鼠免疫球蛋白IgG1 Fc段融合基因的重组Ⅰ型腺相关病毒(rAAVⅠ/ratTNFR:Fc),并对该病毒在Lewis大鼠体内的表达和生物学活性进行初步研究,探讨以该重组腺相关病毒载体应用于类...
关键词：腺相关病毒 因治疗 瘤坏死因子 风湿关节炎

sTNFRⅡ-gAD融合蛋白聚合体表达、制备及生物学特性研究
[学位论文] 陆月， 2011 - 温州医学院：遗传学
关键词：

应用于心血管方面的文章：

重组腺相关病毒2型载体-血管内皮生长因子165改善小型猪慢性心肌缺血的研究 (被引用 5 次)
[期刊论文] 《中华心血管病杂志》 ISTIC PKU -2005年8期
邓晓莉，吴小兵，蒋捷，郭艳红鄢华，施冰，陈明，杨阳，王纪琛，王霄英，邱建新，高莉，高炜，
目的应用重组腺相关病毒2型载体(recombinant adenovirus -associated virus 2,rAAV2)介导血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor,VEGF165)基因转染,观察其促进小型猪慢性缺血心肌血管生成并改善心肌...
关键词：心肌缺血 腺相关病毒 血管内皮生长因子

重组腺相关病毒载体介导成纤维细胞生长因子2基因诱导缺血心肌血管新生 (被引用 4 次)
[期刊论文] 《中国动脉硬化杂志》 ISTIC PKU -2004年6期
袁洪，黄志军，吴小兵，彭建强，闾宏伟，阳国平，唐晓鸿
探讨重组2型腺相关病毒载体介导2型成纤维细胞生长因子基因诱导家兔缺血心肌血管生成的作用.实验对象为20只新西兰兔,手术建立心肌缺血模型后随机分为成纤维细胞生长因子基因治疗组和对照组,分别向缺血区域心肌注射成纤...
关键词：病理学与病理生理学 腺相关病毒 成纤维细胞生长因子 缺血心肌 血管新生 基因治疗

重组腺相关病毒载体介导人血管内皮生长因子165基因对缺血心肌血管新生的影响 (被引用 8 次) [期刊论文] 《中国动脉硬化杂志》 ISTIC PKU -2004年6期
黄志军，袁洪，曾钧发，吴小兵，彭建强，易斌，阳国平
为了研究重组2型腺相关病毒载体介导人血管内皮生长因子165(hVEGF165)基因对兔缺血心肌血管新生的影响,选取了40只新西兰兔,建立心肌缺血模型后随机分为血管内皮生长因子高、中、低剂量组及对照组等4组,分别向缺血区域心肌...
关键词：病理学与病理生理学 腺相关病毒 血管内皮生长因子 缺血心肌 血管新生 基因治疗

反义凝血酶受体和p21双基因共表达对损伤的大鼠颈总动脉的影响
米立国 孟宪敏 赵秀文 刘冬青 王学礼 吴小兵 丁金凤.中国循环杂志.2001,16(5):385-388.
目的：观察反义凝血酶受体（ATR）和p21双基因治疗对WKY大鼠颈总动脉损伤后新生内膜的抑制效果，探寻基因治疗再狭窄的有效途径。
方法：将42 只雄性WKY大鼠随机分成基因治疗组、载体对照组和正常对照组。构建含有ATR和p21双基因及含有绿色荧光蛋白基因的腺病毒伴随病毒载体，用重组单纯疱疹病毒生产体系包装重组腺病毒伴随病毒.导入拉伤的WKY大鼠的颈总动脉。分别于术后2、4、6 周取材，用半定量—逆转录多聚酶链反应和免疫组织化学方法检测凝血酶受体ATR和p21 在动脉壁中的表达。图像分析和统计学检验双基因的疗效。 结果：逆转录多聚酶链反应和免疫组织化学结果显示外源基因已导入血管壁的新生内膜和中膜并获得稳定表达。图像和统计学分析说明：基因治疗后2、4、6 周，双基因治疗组（ATR和p21 ）的颈总动脉内膜厚度分别较载体对照组组内膜减少......；中膜厚度分别减低......；中膜细胞密度减低......
结论：ATR和p21 双基因共表达可明显抑制损伤血管的内膜和中膜细胞的增殖。
新型血清型 1型重组腺相关病毒载体携带血管内皮生长因子基因促血管生成的实验研究
鄢华 吴小兵郭艳红张鹏 陈莉 董小岩 王贵松 高炜.中华心血管病杂志。2007，35（1）：69-73。
目的探讨采用腺相关病毒血清型1型的衣壳蛋白构建的“假毒粒”型重组腺相关病 毒(rAAV)1载体介导血管内皮生长因子(VEGF)促血管新生的可行性、有效性。方法 以每个细胞 10 vg rAAV1．绿色荧光蛋白(GFP)及rAAV1-VEGF载体量感染C2C12细胞(小鼠成肌细胞)分化的肌 管，荧光显微镜下观察rAAV1-GFP的转染效率。ELISA法检测rAAV1-VEGF转染后细胞上清中 VEGF表达量。构建小鼠后肢缺血模型，术后10天每只小鼠股部缺血骨骼肌内注射3×10“vg的 rAAV1-VEGF载体，载体转染后1个月ELISA法检测小鼠缺血骨骼肌中VEGF蛋白表达量。载体转 染后6周免疫组化检测小鼠缺血骨骼肌中毛细血管及小动脉新生情况。结果 rAAV1．GFP感染后 120 h 60％ ～80％的肌管可表达GFP。rAAV1-VEGF载体感染后第3天细胞上清中分泌的VEGF表达 量达到高峰，VEGF浓度为(567．7 ±16．8)ps／ml。小鼠缺血骨骼肌中rAAV1．LacZ载体转染后1个 月转染效率可达100％ 。rAAV1-VEGF载体转染后1个月平均VEGF浓度为(205．4 ±36．1)pg／mg 总蛋白，与对照组相比差异有统计学意义(P<0．O1，n=5)。rAAV1-VEGF载体转染有效促进了血管新生(P<0．001，n=6)，载体转染6周缺血骨骼肌中毛细血管计数与小动脉计数分别为(147．0± 13．3)／lIlIn ，(17．0±1．2)／lIlIn 。结论新型“假毒粒”型rAAV1-VEGF载体可能是治疗缺血性心血管疾病更为优越的基因治疗载体。

Superior neovascularization and muscle regeneration in ischemic skeletal muscles following VEGF gene transfer by rAAV1 pseudotyped vectors
Yan H, Guo Y, Zhang P, Zu L, Dong X, Chen L, Tian J, Fan X, Wang N, Wu X, Gao W. Biochem Biophys Res Commun. 2005 Oct 14;336(1):287-98.Department of Cardiology, Peking University Third Hospital, No. 49, North Garden Road, Beijing 100083, China.
Recombinant adeno-associated virus serotype 2 (rAAV2) vector has been widely employed for gene therapy. Recent progress suggests that the new serotypes of AAV showed a better performance than did AAV2 in normal tissues. Here, we evaluate the potential role of human vascular endothelial growth factor (VEGF) gene transfer using rAAV vector pseudotyped with serotype 1 capsid proteins (rAAV1) in the treatment of muscle ischemia. In ischemic skeletal muscles, the rAAV1-LacZ vector allowed higher level, broader distribution, and long-lasting gene expression compared with the rAAV2-LacZ vector. Muscle VEGF165 production following the rAAV1-VEGF165 vector injection was 5-10 times higher than that following the rAAV2-VEGF165 vector injection. VEGF165 production mediated by the rAAV1-VEGF165 vector stimulated a large set of neovascularization with relatively mature vascular structures and enhanced muscle regeneration in the ischemic skeletal muscles. Thus, the rAAV1-VEGF165 vector mediated gene transfer may be a therapeutic approach to peripheral

重组腺相关病毒载体介导人型血管内皮生长因子基因对缺血心肌血管新生的影响
[期刊论文] 《中华心血管病杂志》 ISTIC PKU -2004年z1期
黄志军，袁洪，曾钧发，吴小兵，彭建强，易斌

过表达P27基因抑制血管损伤后新生内膜的形成
[期刊论文] 《中华心血管病杂志》 ISTIC PKU -2004年z1期
田清平，霍勇，郭艳红，孟磊，王贵松，喻卓，吴小兵，高炜

腺相关病毒载体对心肌细胞感染和外源基因表达的作用 (被引用 3 次)
[期刊论文] 《中国临床康复》 ISTIC PKU -2003年30期
鲁晓春，李小鹰，马鑫，袁振华，吴小兵
目的:为进一步研究肌质网钙 ATP酶转基因在心力衰竭中的质粒价值,并观察腺相关病毒对心肌细胞感染的动态过程和对外源基因的表达能力. 方法:构建含肌质网钙 ATP酶的腺相关病毒载体( recombinant adeno-associated virus...
关键词：腺病毒科 基因疗法 心力衰竭,充血性

质粒介导RNA干涉抑制心肌细胞受磷蛋白表达的实验研究 (被引用 1 次)
[期刊论文] 《中华老年心脑血管病杂志》 ISTIC PKU -2003年6期
鲁晓春，李小鹰，马鑫，袁振华，吴小兵
目的构建用于治疗心力衰竭的受磷蛋白短发夹环RNA表达质粒,并比较它们在心肌细胞中抑制受磷蛋白表达的效率.方法从人基因组DNA中用聚合酶链反应扩增出人U6 snRNA启动子,接以被9nt序列间隔的20、21nt序列的受磷蛋白反向重...
关键词：RNA 钙结合蛋白质类 基因转移 心肌 质粒 心力衰竭,充血性

重组腺病毒介导的肌浆网钙ATP酶在大鼠心肌细胞的过表达
[期刊论文] 《军医进修学院学报》 ISTIC PKU -2004年2期
鲁晓春，李小鹰，袁振华，李世英，马鑫，吴小兵
目的:为研究和评估 SERCA2a 在充血性心力衰竭的基因治疗中的价值和 SERCA2a 转基因对心力衰竭病生理的影响.方法:采用重组腺病毒 AdEasy 系统,构建了含SERCA2a cDNA的重组病毒载体 rAd-trSERCA2a.感染培养的乳鼠心肌细...
关键词：心力衰竭,充血性 重组腺病毒 SERCA2a 基因疗法

直接心肌内注射血管内皮生长因子基因对慢性缺血心肌侧枝循环生成的影响 (被引用 3 次)
[期刊论文] 《中国临床保健杂志》 ISTIC -2006年1期
施冰，邓晓莉，吴小兵，高炜
目的观察血管内皮生长因子基因(rAAV2-hVEGF165)直接心肌内注射促进慢性缺血心肌侧枝循环生成的作用.方法小型猪左冠状动脉回旋支放置血管缩窄环,建立慢性心肌缺血模型.5周后应用心电图、冠脉造影和心脏核磁共振成像确认...
关键词：心肌缺血 血管内皮生长因子类 猪,雏形 动物替代试验

rAAV2-VEGF165治疗小型猪急性冠状动脉闭塞的有效性研究 (被引用 1 次)
[期刊论文] 《中国介入心脏病学杂志》 ISTIC -2004年6期
蒋捷，邓晓莉，陈明，杨阳，施冰，康禹，吴小兵，高炜
目的在小型猪急性冠状动脉(冠脉)闭塞模型上,探讨重组腺相关病毒载体携带人血管内皮生长因子165基因(rAAV2-VEGF165)治疗冠脉闭塞性疾病的有效性及其量效关系,为进一步应用rAAV2-VEGFi65治疗慢性心肌缺血的研究探索较合...
关键词：血管内皮生长因子 心肌缺血 基因疗法 依赖病毒

AAV载体介导的人β2-AR、EGFP基因导入心肌细胞的研究
[期刊论文] 《中国病理生理杂志》 ISTIC PKU -2000年10期
高文谦，李小鹰，吴小兵，李梁，裴雪涛
目的:观察腺相关病毒(adeno-assoiated virus,简称AAV)载体介导的人β2肾上腺素能受体(简称β2-AR)基因和增强型绿色荧光蛋白基因(简称EGFP)对心肌细胞的转染及其表达. 方法:构建以串联方式携带β2-AR、EGFP基因的AAV载体,...
关键词：

人源碱性成纤维细胞因子基因对缺血心肌血管新生的影响 (被引用 1 次)
[期刊论文] 《中国医学工程》 -2006年1期
刘勇，黄志军，袁洪，吴小兵，彭建强，阳国平
目的探讨人源碱性成纤维细胞因子(hbFGF)基因对兔缺血心肌血管生成的影响.方法分别向40只新西兰兔心肌缺血模型的心肌注射1010、1012、1013v.g./Kg的携带hbFGF cDNA的腺相关病毒载体或磷酸盐缓冲液.4周后取心肌组织,采用R...
关键词：碱性成纤维细胞因子 重组腺相关病毒 心肌缺血 血管新生 基因治疗

过表达p27基因抑制血管损伤后新生内膜的形成
[期刊论文] 《中国介入心脏病学杂志》 ISTIC -2004年5期
田清平，霍勇，郭艳红，孟磊，王贵松，喻卓，吴小兵，高炜
目的探讨p27基因转染对血管损伤后新生内膜形成的影响.方法以腺病毒为载体转染p27基因,用MTT法观察其对血管平滑肌细胞增殖的影响,用流式细胞仪检测细胞周期;在兔颈总动脉球囊损伤模型上转染p27基因,采用免疫组织化学法...
关键词：基因,p27 血管内膜

腺病毒、腺相关病毒载体转导心肌细胞的研究
[期刊论文] 《中国应用生理学杂志》 ISTIC PKU -2001年2期
高文谦，李小鹰，吴小兵，裴雪涛，李梁
目的和方法:构建含人β2肾上腺素能受体(β2-AR)基因的重组腺病毒(rAd)和腺相关病毒(rAAV),并感染体外培养的心肌细胞,检测目的基因在心肌细胞内的表达.结果:RT-PCR检测结果显示感染的心肌细胞均表达人β2-AR mRNA;western...
关键词：腺病毒载体 腺相关病毒载体 人β2肾上腺素能受体基因 心肌细胞

腺病毒相关病毒载体介导人β2肾上腺素能受体、增强型绿色荧光蛋白基因导入心肌细胞的表达 (被引用 2 次)
[期刊论文] 《中华老年医学杂志》 ISTIC PKU -2001年4期
高文谦，李小鹰，吴小兵，李梁，裴雪涛
目的探讨充血性心力衰竭(心衰)及其他心脏疾病的基因治疗途径. 方法构建携带人β2肾上腺素能受体(β2-AR)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)双基因的腺病毒相关病毒(adeno-associated virus,AAV)载体,感染大鼠的心肌细胞,检测心...
关键词：腺病毒,人 受体,肾上腺素能 基因 荧光抗体技术

SARS病毒方面的文章：

抗人SARS病毒单链抗体库的构建 (被引用 4 次)
[期刊论文] 《细胞与分子免疫学杂志》 ISTIC PKU -2005年4期
赵爱志，彭建强，曹晖，康禹，崔莲仙，吴小兵，何维
目的:利用细胞内重组的方法, 构建大库容量的人源性抗SARS病毒单链抗体(scFv)库, 为筛选SARS病毒抗原的人源性抗体奠定基础.方法: 取6例SARS康复患者的80 mL 外周血, 分离淋巴细胞后提取总RNA.分离纯化mRNA 并反转录成c...
关键词：冠状病毒 单链抗体库 细胞内重组

SARS病毒N蛋白特异性单链抗体的筛选 (被引用 1 次)
[期刊论文] 《中华微生物学和免疫学杂志》 ISTIC PKU -2005年8期
赵爱志，杨宇，袁振华，董小岩，连忠辉，崔莲仙，吴小兵，何维
目的利用大容量人源性SARS单链抗体库筛选N蛋白的特异性单链抗体. 方法利用RT-PCR的方法克隆了SARS病毒的N蛋白基因,克隆入原核表达载体pBV220,在大肠杆菌DH5α中进行表达并经离子交换色谱纯化后得到了纯度达95%以上的N蛋...
关键词：SARS冠状病毒 N蛋白 单链抗体库

新型冠状病毒血清学和病原学的临床相关研究 (被引用 1 次)
[期刊论文] 《中华医院感染学杂志》 ISTIC PKU -2005年1期
范保星，解立新，田庆，陈良安，刘又宁，陈唯军，邱燕，吴小兵
目的探讨SARS患者和康复者的血清学和病原学变化;筛选SARS康复者淋巴细胞中差异表达的基因. 方法 ELISA、冠状病毒全基因组芯片、抑制消减杂交(SSH). 结果 80.4%的SARS康复者和2%的密切接触者SARS-CoV的IgG抗体为阳性,康复...
关键词：基因芯片 SARS IgG 康复

SARS病毒全基因组芯片在临床检测中的应用 (被引用 4 次)
[期刊论文] 《解放军医学杂志》 ISTIC PKU -2003年11期
范保星，刘又宁，孟凡义，任鲁风，吴小兵，张猛
目的利用冠状病毒全基因组芯片检测SARS患者血、便和痰标本中的冠状病毒核酸,为SARS病毒核酸的诊断提供线索.方法提取SARS患者血、便和痰样本中的冠状病毒RNA,经全基因组随机反转录和PCR扩增标记成荧光探针,与SARS病毒全基...
关键词：冠状病毒 基因芯片 严重急性呼吸综合征(SARS)

用SARS冠状病毒全基因组芯片杂交方法分析SARS-CoV (被引用 3 次)
[期刊论文] 《中国生物工程杂志》 ISTIC PKU -2003年7期
吴小兵，任鲁风，马鑫，何新洲，袁振华，刘凤杰，赵革新，杨宇，张猛，董小岩，侯云德
为从临床样品中检测和分析SARS-CoV病毒打基础,并为分析SARS-CoV病毒的复制和转录等机理提供一种有效方法.以SARS冠状病毒 TOR2株序列作为标准设计和制备一种覆盖SARS冠状病毒全基因组的寡聚核苷酸芯片,探针长度为70nt,...
关键词：SARS冠状病毒(SARS-CoV) 全基因组 基因芯片 全基因组扩增

全基因组扩增策略在基因芯片分析SARS冠状病毒实验中的应用 (被引用 2 次)
[期刊论文] 《中国生物工程杂志》 ISTIC PKU -2004年3期
赵革新，任鲁风，刘凤杰，何新舟，董小岩，吴小兵，侯云德
针对SARS冠状病毒的分子生物学检测是控制SARS流行的关键环节.为评价全基因组扩增对SARS微量样本检测的影响,采用6-mer随机引物反转录,用加接头的随机引物合成第二链,再以接头序列为引物扩增并掺入荧光标记,最后与带有7...
关键词：SARS冠状病毒 全基因组扩增 基因芯片

血、便、痰和尿标本中SARS冠状病毒核酸的检测和病毒基因谱的初步建立 [期刊论文] 《军医进修学院学报》 ISTIC PKU -2003年4期
陈良安，范保星，孟凡义，解立新，田庆，佘丹阳，方向群，刘又宁，任鲁风，吴小兵，张猛
目的:利用冠状病毒全基因组芯片检测SARS患者血、便、痰和尿标本中的冠状病毒核酸并试图建立其基因谱.方法:提取SARS患者血、便、痰和尿样本中的冠状病毒RNA,经全基因组随机反转录和PCR扩增标记成荧光探针,与SARS病毒全基因...
关键词：冠状病毒属 基因 严重急性呼吸综合征(SARS)

基因芯片技术快速检测SARS病毒 (被引用 19 次)
[期刊论文] 《检验检疫科学》 -2003年5期
周琦，赖平安，汪琳，黄文胜，朱水芳，李明福，吴小兵，何新舟，任鲁峰
以SARS冠状病毒TOR2株序列为设计标准,研制出用于检测SARS病毒的全基因芯片,芯片探针长度为70nt,相邻探针序列重复25nt,共660条病毒探针,覆盖了SARS冠状病毒的全部序列,另外设计了内对照探针和阴性对照探针.应用该基因芯...
关键词：SARS冠状病毒 全基因组芯片 检测 检验检疫

10种植物病毒的基因芯片检测技术研究 (被引用 1 次)
[期刊论文] 《植物病理学报》 ISTIC PKU -2007年6期
马新颖，汪琳，任鲁风，高文娜，邓丛良，张永江，吴小兵，相宁，周琦
本研究设计了10种植物病毒和各种对照的探针,将探针固定在醛基化玻璃片基上制备基因芯片.用常规的Trizol法提取植物总RNA,根据病毒的外壳蛋白基因或复制酶基因设计特异性引物,经RT-PCR扩增相应区段并用Cy3-dCTP进行标记...
关键词：基因芯片 植物病毒 检测

AAV载体在血友病基因治疗中的应用：

Gene therapy for hemophilia B mediated by recombinant adeno-associated viral vector with hFIXR338A, a high catalytic activity mutation of human coagulation factor IX
陆华中 陈立 王红卫 伍志坚 吴小兵 王学峰 王鸿利 卢大儒 邱信芳 薛京伦。SCIENCE IN CHINA (LIFE SCIENCES)，2001?44(6)：585-592。The State Key Laboratory of Genetic Engineering, Institute of Genetics, School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200433, China，The State Key Laboratory of Molecular Virology and Gene Engineering, Chinese Academy of Preventive Medical Sciences, Beijing 100050, China，Shanghai Institute of Hematology, Ruijin Hospital of Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025, China。
A mutant human factor IX with arginine at 338 residual changed to alanine (hFIXR338A) by site-directed mutagenesis was introduced into AAV vectors, and a recombinant adeno-associ- ated viral vector containing hFIXR338A, prepared by rHSV/AAV hybrid helper virus system, was directly introduced to the hind leg muscle of factor IX knock out mice. The expression and the biological activity of human factor IX mutant, hFIXR338A, and the immune response against it in the treated mice were assayed and detected. The results showed that (i) the high-level expression of human factor IX mutant protein, hFIXR338A, has been detected in rAAV-hFIXR338A treated hemophilia B mice and lasted more than 15 weeks; (ii) the clotting activity of hFIXR338A in plasma is 34.2%± 5.23%, which is remarkably higher than that of (14.27% ± 3.4%) of wild type hFIX treated mice in the activated partial thromboplastin assay; (iii) immune response against factor IX R338A was absent, with no factor IX mutant protein (hFIXR338A) inhibitors development in the treated mice; and (iv) no local or systemic side-effects and toxicity associated with the gene transfer were found. It demonstrated the potential use of treating hemophilia B by recombinant adeno-associated viral vectors with mutant hFIXR338A gene, an alternative strategy for hemophilia B gene therapy to wild-type human factor IX.

Non-invasive viral gene transfer of factor IX to colonic epithelial cells in hemophilia B mice
Peng J, Wang H, Ma Y, Wu X, Chen F.J Thromb Haemost. 2008 Jun;6(6):1033-1056. Department of Haematology, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha; National Laboratory of Molecular Virology and Genetic Engineering, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing; and Vector Gene Technology Company Ltd, Beijing, China。

Analysis of Adeno-Associated Virus-Mediated ex vivo Transferred Human β-Globin Gene in Bone Marrow Engrafted Mice

重组腺相关病毒（rAAV）介导的人凝血因子IX高活性突变衍生物在血友病B基因治疗研究中的应用

肌注腺伴随病毒基因治疗血友病B的安全性研究
邹蓓艳，陈立，伍志坚，吴小兵，卢大儒，邱信芳，薛京伦。.病毒学报.2001,17(4):301-306。复旦大学生命科学学院遗传学研究所遗传工程国家重点实验室上海；中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室。
研究了肌注腺伴随病毒（AAV）介导凝血因子9基因治疗血友病B的安全性。首先采用反转录...

HSV/AAV嵌合病毒法制备rAAV/hFⅨ及其安全性检测 (被引用 4 次)
[期刊论文] 《科学通报》 ISTIC PKU -2003年10期
陈立，邹蓓艳，陈浩明，伍志坚，吴小兵，卢大儒，薛京伦
构建了由CMV启动子调控的人凝血因子Ⅸ小基因的重组腺相关病毒载体, 并通过HSV/AAV杂合辅助病毒的方法大量制备成重组腺相关病毒颗粒(rAAV/hFⅨ). 经Southern dot blot及QC-PCR法测定, 滴度达到3.6 × 1012 vg(病毒基因组)...
关键词：重组腺相关病毒载体 人凝血因子Ⅸ小基因 杂合病毒 QC-PCR

Muscle injection of rAAV/mFIX to secrete clotting factor IX corrects the hemorrhagic tendencies in hemophilia B mice [期刊论文] 《中国科学C辑(英文版)》 SCI -2003年4期
陈立，陈浩明，陆华中，吴小兵，卢大儒，邱信芳，薛京伦
Recombinant AAV particles of high titer (>1013 virus genome/mL) were prepared according to the rHSV/AAV helper virus method. After intramuscular injection of viral vectors in the hind limb, a sustained...
关键词：hemophilia B mouse gene therapy AAV HSV

腺相关病毒载体介导的人凝血因子Ⅸ基因在CD34+造血干/祖细胞中的表达 (被引用 1 次)
[期刊论文] 《中华血液学杂志》 ISTIC PKU -2005年9期
陈焱，陈方平，彭建强，吴小兵，王光平，蹇在伏，信红亚，吴新华
目的研究2型重组腺相关病毒(rAAV-2)介导的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)基因在脐血CD34+细胞及其子代细胞中的表达.方法采用rAAV-2/hFⅨ转导经预刺激的人脐血CD34+细胞,分别向粒单系、巨核系和红系分化培养21 d,从转录水平、蛋白质水平...
关键词：2型腺相关病毒 全能干细胞 多能干细胞 因子Ⅸ

重组AAV2/hFⅨ病毒制备及其基因治疗血友病B的实验研究 (被引用 2 次)
[期刊论文] 《中华血液学杂志》 ISTIC PKU -2004年9期
彭建强，董小岩，彭忞，陈立，谭淑萍，袁洪，陈方平，薛京伦，吴小兵
目的制备携带人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)基因的重组AAV2病毒(rAAV2/hFⅨ),并对用rAAV2/hFⅨ肌肉注射治疗血友病B模型小鼠的疗效进行评价.方法通过"一株载体细胞/一株辅助病毒"的双因素包装策略制备出rAAV2/hFⅨ,体外转导BHK-21、C2C1...
关键词：腺病毒,人 因子Ⅸ 血友病B 基因疗法

重组腺相关病毒2型/人凝血因子IX的质量研究 (被引用 4 次)
[期刊论文] 《药学学报》 ISTIC PKU -2003年9期
高凯，王军志，饶春明，吴小兵
目的研究并建立重组腺相关病毒2型/人凝血因子IX(recombinant adeno-associated virus type 2/human blood coagulation factor IX,rAAV-2/hFIX)的质量标准.方法采用PCR法确认病毒所携带的重组核酸结构和测定辅助病毒(h...
关键词：基因治疗 腺相关病毒 人凝血因子 质量控制

腺相关病毒介导的小鼠Ⅸ因子在血友病B小鼠体内表达研究 (被引用 5 次)
[期刊论文] 《中国科学C辑》 ISTIC PKU -2003年2期
陈立，陈浩明，陆华中，吴小兵，卢大儒，邱信芳，薛京伦
通过重组HSV/AAV辅助病毒方法制备出高滴度(>1012)的重组AAV/mFⅨ病毒颗粒, 并注射到血友病B小鼠的后肢骨骼肌中, 获得了稳定的高水平小鼠Ⅸ因子表达(>370 ng/mL), 持续时间超过350 d. 治疗组小鼠体内的Ⅸ因子活性达到正常...
关键词：血友病B小鼠 基因治疗 重组腺相关病毒载体 单纯疱疹病毒

重组腺相关病毒介导的人凝血因子IX基因在人/鼠结肠癌上皮细胞中的表达
[期刊论文] 《温州医学院学报》 ISTIC -2008年2期
马泳泳，陈方平，杜建伟，陈焱，彭建强，吴小兵，解勤之
目的:探讨重组腺相关病毒/人凝血因子Ix基因(rAAV-2/hFIX)在人/鼠结肠癌上皮细胞(SW480/C26细胞株)中的表达.方法:重组腺相关病毒/绿色荧光蛋白(rhhV-2/GFP)感染SW480/C26细胞,在荧光显微镜下观察GFP的表达,计算转染率....
关键词：血友病B 基因治疗法 重组腺相关病毒 人凝血因子IX基因:结肠上皮细胞

AAV载体用于器官移植和抗免疫排斥:

Long-term liver allograft survival induced by combined treatment with rAAV-hCTLA4Ig gene transfer and low-dose FK506
Yang Z, Wu X, Tsui TY, Hou Y, Luk JM, Fan ST. Transplantation. 2003 Feb 15;75(3):303-8.Centre for the Study of Liver Disease and Department of Surgery, University of Hong Kong Medical Centre, Queen Mary Hospital, Hong Kong, China.
BACKGROUND: Recombinant adeno-associated virus vector (rAAV) is a promising vehicle for gene delivery, but few reports have documented its application in solid organ transplantation. In a rat orthotopic liver transplantation model, we investigated the efficacy of rAAV-mediated human cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4 and immunoglobulin G (hCTLA4Ig) gene transfer to induce long-term allograft survival. METHODS: Dark Agouti and Lewis rats were used as donors and recipients, respectively, in six experimental groups: (a) syngeneic control, (b) no treatment, (c) rAAV-green fluorescent protein, (d) rAAV-hCTLA4Ig, (e) low-dose FK506 for 7 days, and (f) rAAV-hCTLA4Ig and low-dose FK506 for 7 days. RESULTS: The liver allografts were rejected within 10 days when no treatment was given or rAAV-green fluorescent protein was delivered. rAAV-hCTLA4Ig transduction slightly prolonged the survival time to 11 days. Long-term survival was achieved using the combined treatment of rAAV-hCTLA4Ig and low-dose FK506, whereas grafts were rejected on day 33 in the low-dose FK506 group. A sustained hCTLA4 level in plasma was detected in the combined treatment group from day 5 to day 180. On postoperative day 5, combined treatment significantly decreased the interleukin-2 and interferon-gamma protein levels in the grafts and the number of infiltrating B, T, CD25+, CD4+, CD8+, and NK cells. CONCLUSIONS: This study shows that rAAV-hCTLA4Ig gene transfer combined with low-dose FK506 can achieve long-term liver allograft survival.
Recombinant Adeno-Associated Virus Vector: Is it Ideal for Gene Delivery in Liver Transplantation
Zhen-Fan Yang,* Xiao-Bing Wu,? Tung-Yu Tsui,* Yun-De Hou,? John M. Luk,*
and Sheung-Tat Fan。Liver Transplantation, Vol 9, No 4 (April), 2003: pp 411-420。Centre for the Study of Liver Disease and Department of Surgery, University of Hong Kong Medical Centre, Queen Mary Hospital, Hong Kong; and the ?National Laboratory of Molecular Virology and Genetic Engineering, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing, China.
Recombinant adeno-associated virus vector (rAAV) is an effective and safe gene-delivery tool. However, its application in solid-organ transplantation has not been addressed. The present study is designed to introduce human cytotoxic
T-lymphocyte–associated antigen 4 immunoglobulin G (hCTLA4Ig) by rAAV (rAAV-hCTLA4Ig) into rat liver grafts to analyze the effects of virus titer, exposure time, and route of administration on transgene expression and possible side effects caused by the gene-delivery approach. Different rAAV-hCTLA4Ig titers were introduced into liver grafts through back-table portal vein perfusion and preserved for a certain time. rAAV-hCTLA4Ig also was administered by intravenous and intramuscular injection. Transgene expression in grafts and plasma was detected by immunohistochemistry and enzyme-linked immunosorbent assay. Intragraft
cytokine level was detected by reverse-transcriptase polymerase chain reaction. Anti-hCTLA4Ig antibodies in plasma were detected by flow cytometry. A higher virus titer (1 * 1012 viral genomes/animal) introduced through backtable portal vein perfusion and a longer preservation time (3 hours) achieved a greater level of transgene expression until day 180. Back-table portal vein perfusion induced a greater level of hCTLA4 expression in plasma than intramuscular or intravenous injection. Increased interleukin-2 and interferon- messenger RNA levels were detected in grafts with rAAV-hCTLA4Ig gene transfer compared with those without
virus delivery, but the response was minor. Such a cellular immune response could be suppressed by low-dose FK506 administration during the first 3 postoperative days. Anti-hCTLA4Ig antibodies could be detected in long-term surviving animals, but the extent of humoral response was not severe. This study shows that rAAV can be an effective and safe vector for gene delivery in liver transplantation.
prevention of chronic deterioration of heart allograft by recombinant adeno-associated virus-mediated heme oxygenase-1 gene transfer
Tsui TY, Wu X, Lau CK, Ho DW, Xu T, Siu YT, Fan ST. Circulation. 2003 May 27;107(20):2623-9. Epub 2003 May 5.Department of Surgery, University of Hong Kong Medical Centre, Queen Mary Hospital, 102 Pokfulam Rd, Hong Kong. tytsui@hkucc.hku.hk
BACKGROUND: Allograft deterioration is the major obstacle to organ transplantation as a long-term treatment of end-stage heart failure. In this study, we transduced the antioxidant gene, heme oxygenase-1 (HO-1), to heart grafts using a recombinant adeno-associated viral vector (rAAV) in a rat heart transplantation model and investigated its potentiality in prevention of chronic graft deterioration. METHODS AND RESULTS: rAAV/HO-1 was administered to heart grafts through the coronary arteries during cold preservation. We investigated the expression patterns and activities of transgene, graft survival, graft histomorphology, and relevance of HO-1 expression on graft survival and chronic graft deterioration by itself. Long-term allograft survival can be achieved by rAAV/HO-1-mediated stable transgene expression. The development of graft arteriosclerosis and interstitial fibrosis was prevented in rAAV/HO-1-transduced allografts on day 100. rAAV/HO-1-mediated long-term graft protection was accompanied by remarkable downregulation of the intragraft mRNA level of macrophage migration inhibitory factor, tumor necrosis factor-alpha, and transforming growth factor-beta1. Blockage of HO activities by zinc protoporphyrin IX at different posttransplant phases showed that the stable expression of HO-1 is a prerequisite for both survival of grafts and prevention of graft arteriosclerosis. CONCLUSIONS: rAAV/HO-1 gene transfer represents a novel therapeutic approach to prevent chronic allograft deterioration in clinical heart transplantation
rAAV-Mediated Stable Expression of Heme xygenase-1 in Stellate Cells: A New Approach to Attenuate Liver Fibrosis in Rats
Tsui TY, Lau CK, Ma J, Wu X, Wang YQ, Farkas S, Xu R, Schlitt HJ, Fan ST.Hepatology. 2005 Aug;42(2):335-42.Center for the Study of Liver Disease, University of Hong Kong, Pokfulam, Hong Kong, China. tung-yu.tsui@klinik.uni-regensburg.de
Liver fibrosis is the consequence of activation of hepatic stellate cells mediated by persistent or recurrent liver injury, where oxidative stress or inflammatory response resulting from immune cells and cytokines are involved. Targeting of hepatic stellate cells could be an important strategy for the therapy of liver fibrosis. In this study, we showed a tropism of recombinant adeno-associated virus (rAAV, serotype 2) with high efficiency in transduction of a homeostatic gene, heme oxygenase-1 (HO-1), to activated stellate cells. The binding of rAAVs to stellate cells increased significantly after serum-stimulated activation compared with quiescent status. Portal injection of rAAVs to normal or carbon tetrachloride (CCl(4))-induced liver fibrosis showed a distinct distribution of rAAV binding. The majority of injected rAAVs bound to the cells in fibrotic areas that were associated with higher expression levels of fibroblast growth factor receptor-1alpha at 2 hours after administration. Isolation of different types of cells from CCl(4)-induced fibrotic livers showed predominant expression of transgene in stellate cells after rAAV/HO-1 administration on day 3 and remained stable for 12 weeks. In addition, HO-1-transduced stellate cells showed reduced transcript levels of type 1 collagen and impaired proliferative ability compared with controls. With this approach, the severity of established micronodular cirrhosis was markedly reduced. In conclusion, these findings suggest a new approach for the treatment of liver fibrosis using adeno-associated virus-mediated gene transfer.

AAV体外介导hCTLA4-Ig 在新生猪胰岛细胞中的表达与生物学活性
莫朝晖 ，王 维 ，刘 涛’，曾秋华’，吴小兵 ，谢艳红。中南大学学报（医学版），2007，32(1)：36-40。中南大学 1．湘雅三医院细胞移植与基因治疗研究所，长沙4l00l3；2．湘雅三医院内分泌科， 长沙4l00l 3；3．湖南省生殖与干细胞工程研究所，长沙4l0078；4．中国预防医学科学研究所 病毒基因工程国家重点实验室，北京l00052
目的：探讨AAV-hCTLA4·Ig体外感染猪胰岛细胞后，hCTLA4·，g基因的表达能力及生物学 活性。方法：腺相关病毒载体(AAV)介导hCTLA4-Ig体外转染新生猪胰岛细胞(NIPs)，用RT-PCR和免 疫细胞化学法检测胰岛细胞内hCTLA4-，g mRNA及蛋白质水平的表达。转染后的新生猪胰岛细胞与人 淋巴细胞共孵育，通过ELISA法检测培养基中1L-2，IFN-r， TNF-α细胞因子水平的变化。并观察转染组 与对照组葡萄糖刺激后的胰岛素释放反应。结果：转染组NIPs可检测到hCTLA4．，g基因及蛋白表达；与人淋巴细胞共孵育后IL-2，TNF-α，IFN-r 浓度明显低于对照组(P<0．01)；且葡萄糖刺激胰岛素释放反 应与对照组无明显差异(P>0．05)。结论：AAV-CTLA4-Ig体外转染的胰岛细胞能够表达具有生物学活 性的hCTLA4-Ig，可抑制T细胞激活，而胰岛细胞生理功能不受影响。

Active Tolerance Induction and Prevention of Autoimmune Diabetes by Immunogene Therapy Using Recombinant Adenoassociated Virus
Han G, Li Y, Wang J, Wang R, Chen G, Song L, Xu R, Yu M, Wu X, Qian J, Shen B. J Immunol. 2005 Apr 15;174(8):4516-24.Department of Molecular Immunology, Institute of Basic Medical Sciences, Beijing, People's Republic of China.
Tolerance induction of autoreactive T cells against pancreatic beta cell-specific autoantigens such as glutamic acid decarboxylase 65 (GAD65) and insulin has been attempted as a method to prevent autoimmune diabetes. In this study, we investigate whether adenoassociated virus (AAV) gene delivery of multiple immunodominant epitopes expressing GAD(500-585) could induce potent immune tolerance and persistently suppress autoimmune diabetes in NOD mice. A single muscle injection of 7-wk-old female NOD mice with rAAV/GAD(500-585) (3 x 10(11) IU/mouse) quantitatively reduced pancreatic insulitis and efficiently prevented the development of overt type I diabetes. This prevention was marked by the inactivation of GAD(500-585)-responsive T lymphocytes, the enhanced GAD(500-585)-specific Th2 response (characterized by increased IL-4, IL-10 production, and decreased IFN-gamma production; especially elevated anti-GAD(500-585) IgG1 titer; and relatively unchanged anti-GAD(500-585) IgG2b titer), the increased secretion of TGF-beta, and the production of protective regulatory cells. Our studies also revealed that peptides 509-528, 570-585, and 554-546 in the region of GAD(500-585) played important roles in rAAV/GAD(500-585) immunization-induced immune tolerance. These data indicate that using AAV, a vector with advantage for therapeutic gene delivery, to transfer autoantigen peptide GAD(500-585), can induce immunological tolerance through active suppression of effector T cells and prevent type I diabetes in NOD mice.

Gene delivery GAD500 autoantigen by AAV serotype 1 prevented diabetes in NOD mice: Transduction efficiency do not play important roles
Han G, Wang R, Chen G, Wang J, Xu R, Feng J, Yu M, Wu X, Qian J, Shen B, Li Y.Immunol Lett. 2008 Jan 29;115(2):110-6. Epub 2007 Nov 9.Department of Molecular Immunology, Institute of Basic Medical Sciences, Taiping Road, No. 27, Beijing 100850, PR China.
We previously found that adeno-associated viral vector serotype 2 (AAV-2) muscle gene delivery of GAD 500-585 autoantigen efficiently prevented autoimmune diabetes in NOD mice. Recent reports suggest that AAV vectors based on serotype 1 (AAV-1) transduce murine skeletal muscle much more efficiently than AAV-2, with reported increases in expression ranging from 2 to 1000-fold. To determine whether this increased efficacy of AAV-1 could result in increased therapeutic effects in mice, we constructed rAAV1/GAD 500-585 vectors and compared their effects in preventing autoimmune diabetes in NOD mice with those of rAAV2/GAD 500-585 after muscle injection. rAAV(1)/GAD(500-585) gene therapy prevented diabetes in NOD mice. However, although much higher level of GAD 500-585 expression was found in mice using AAV-1 as gene delivery vector than those using AAV-2, no increased efficiency of AAV-1 vectors were found in their capability to prevent autoimmune diabetes, as higher titers of rAAV1/GAD 500-585 virus (3x10(11)v.g./mouse) were needed to obtain therapeutic effects in NOD mice, a titer not different from that of AAV-2. Protection resulted from rAAV1/GAD 500-585 gene therapy were marked by enhanced Th2 immune response and up-regulated CD4+ Foxp3+T regulatory cells, which might actively suppress effector T cells in NOD mice. As here we found that the therapeutic effects of AAV1 were not positively correlated to it's transduction efficiency, our data suggested that the safety and other factors besides efficiency should be considered when use different AAV serotype to treat autoimmune disease.

腺相关病毒介导的大鼠移植肝基因转移(被引用 4 次)
徐峰; 杨甲梅; 钱其军; 阚彤; 吴小兵; 张柏和; 吴孟超;中华器官移植杂志;Chineae Journal of Organ Transplantation;2002年 01期;第二军医大学附属东方肝胆外科医院; 中国预防医学科学院病毒研究所国家重点实验室; 第二军医大学附属东方肝胆外科医院
目的　研究腺相关病毒载体介导的移植肝基因转移的可行性和转导率。方法　以绿色荧光蛋白 (GFP)作为报告基因 ,在大鼠供肝冷保存前经门静脉注入不同剂量 (1× 10 10 pfu/ml、5× 10 10pfu/ml和 1× 10 11pfu/ml)的带有绿色荧光蛋白的腺相关病毒载体 (AAV GFP) ,保存后行异体肝移植 ,术后 2、4及 8周取供肝组织活检 ,运用免疫荧光显微镜和流式细胞仪检测GFP的表达 ,计算转导率 ,观察不同剂量的AAV GFP及不同保存时间 (1h、4h和 10h)对转导率的影响。结果 3个剂量组肝移植术后第 4周移植肝细胞内均可观察到GFP的表达 ,随着AAV GFP剂量的增加 ,转导率也增加 (6 %、15 %和 34 % ) ;随着冷保存时间的延长 ,转导率逐步提高 (15 %、32 %和 5 4% ) ;除移植肝细胞外 ,脑、心、肺、肾、脾脏内均未见GFP的表达 ;与对照组比较 ,移植肝功能的差异无显著性。结论　在模拟临床肝移植条件下 ,利用腺相关病毒可将目的基因转移入移植肝细胞内 ,且能高效表达 ;转导率随病毒剂量的增加、冷保存时间的延长而提高 ;经冷保存......

经hCTLA4-Ig基因转染的猪胰岛细胞在小鼠体内的存活与功能状况研究 [期刊论文] 《中华器官移植杂志》 ISTIC PKU -2007年6期
莫朝晖，王维，刘涛，曾秋华，吴小兵，邢晓为，金萍，卢光琇
目的 研究将人细胞毒T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(hCTLA4-Ig)基因转染至猪胰岛细胞后,再将其移植至小鼠体内的存活及功能状况.方法 采用腺相关病毒载体(AAV)介导hCTLA4-Ig基因体外转染新生猪胰岛细胞(NIPs),再将转基因...
关键词：基因转移技术 猪 胰岛 移植,异种 免疫耐受

大鼠血红素加氧酶-1基因转染对心肌缺血再灌注损伤大鼠炎性因子的影响 (被引用 3 次)
[期刊论文] 《中华麻醉学杂志》 ISTIC PKU -2007年7期
何祥虎，王焱林，王成夭，吴小兵，代乐，李娜
目的 探讨重组腺相关病毒(rAAV)介导大鼠血红素加氧酶-1(HO-1)基因转染对心肌缺血再灌注损伤大鼠炎性因子的影响.方法 雄性SD大鼠93只,体重225～275 g,随机分为4组:假手术组(SH组,n=12)、生理盐水组(NS组,n=27)、重组腺相关...
关键词：血红素氧化酶(脱环) 心肌再灌注损伤 转染 腺病毒科

携带血红素加氧酶1基因的重组腺相关病毒的制备 (被引用 2 次)
[期刊论文] 《武汉大学学报（医学版）》 ISTIC PKU -2007年4期
何祥虎，王焱林，王成夭，吴小兵，代乐，李娜
目的:制备携带大鼠血红素加氧酶1(rHO-1)基因的重组腺相关病毒(AAV).方法:通过RT-PCR的方法,从大鼠脾脏组织中扩增rHO-1基因,克隆入通用型AAV载体质粒pSNAV中构建重组质粒pSNAV-rHO-1,通过酶切和测序鉴定.利用Lipofecta...
关键词：血红素加氧酶1 腺相关病毒 斑点杂交

用于IDDM基因治疗的rAAV2-GAD-Ig的研制
[期刊论文] 《细胞与分子免疫学杂志》 ISTIC PKU -2005年1期
王仁喜，王建安，宋伦，韩根成，沈倍奋，吴小兵，黎燕
目的: 构建重组真核表达载体pSNAV-GAD-Ig[GAD-Ig融合基因是由小鼠GAD(glutamic acid decarboxylase)基因插入到小鼠IgG3重链(Ig)基因的N端而成的], 制备含GAD-Ig融合基因cDNA的重组缺陷型腺相关病毒-2(rAAV2-GAD-Ig), ...
关键词：谷氨酸脱羧酶(GAD) GAD-Ig pSNAV-GAD-Ig rAAV2-GAD-Ig 特异性免疫耐受

AIDS与免疫方面的应用:

1 型和2 型外壳蛋白构建的 AAV载体携带 HIV 21 gag诱导免疫反应的比较研究
刘红梅,余双庆 ,冯霞 ,刘新蕾 ,董小岩 ,吴小兵 ,曾毅. 病毒学报.2007,23(3):177-182。 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所　病毒基因工程国家重点实验室,北京　100052 ; 传染病预防控制国家重点实验室　病毒病预防控制所　中国疾病预防控制中心,北京　100052.
比较两种血清型的腺病毒伴随病毒(Adeno2associated virus ,AAV) 载体携带HIV21 gag 基因肌肉注射诱导 小鼠免疫反应的特点。分别制备携带EGFP 和HIV21 gag 基因的重组AAV2/ 1 (AAV1) 和AAV2 载体。小鼠肌肉注射rAAV12EGFP 和rAAV22EGFP ,观察注射局部EGFP 的表达。将rAAV12gag 和rAAV22gag 分别以0 、3 周初免/ 加强方式肌肉注射免疫BALB/ c 小鼠以及新西兰白兔。EL ISA 法检测抗HIV21 Gag P24 蛋白的特异性抗
体,细胞内细胞因子染色法检测Gag 特异性的CTL 反应。结果表明,rAAV12EGFP 在小鼠肌肉的表达强度显著高 于rAAV22EGFP ;用Western blot 法和间接免疫荧光法检测rAAV12gag 和rAAV22gag 体外转染的293 细胞,均可 检测到HIV21 Gag 蛋白的表达;在小鼠体内rAAV12gag 和rAAV22gag 组均可检测到特异性P24 抗体,抗体滴度 rAAV12gag 组显著高于rAAV22gag 组;而无论rAAV12gag 组还是rAAV22gag 组,特异性CTL 反应均较低,与阴性对照组相比均无显著性差异;两种载体免疫兔子也都可检测到特异性P24 抗体,同样地,rAAV12gag 组显著高于 rAAV22gag 组。结论:携带HIV21 gag 基因的rAAV1 或rAAV2 以肌肉注射方式免疫小鼠主要诱导特异Gag 的体液免疫反应;且rAAV1 可诱导很强的抗HIV21 Gag 特异性抗体,抗体水平显著高于rAAV2 。

含HIV-1 gp120基因的重组腺相关病毒和重组腺病毒疫苗联合免疫的研究 (被引用 1 次)
[期刊论文] 《中华实验和临床病毒学杂志》 ISTIC PKU -2004年4期
冯霞，余双庆，陈国敏，吴小兵，左建民，董温平，周玲，曾毅
目的探讨含HIV-1 gp120基因的重组腺相关病毒(rAAV)和重组腺病毒(rAdV)疫苗在BALB/c小鼠中联合免疫的效果.方法将密码子优化的HIV-1 gp120基因分别插入腺相关病毒(AAV)和腺病毒(AdV)载体质粒,构建含该基因的rAVV和rAdV载...
关键词：HIV-1 艾滋病疫苗 细小病毒科 腺病毒科

含HIV-1 gag、gagV3基因的重组腺病毒伴随病毒的构建及其免疫原性的研究 (被引用 2 次)
[期刊论文] 《病毒学报》 ISTIC PKU -2001年4期
刘雁征，吴小兵，周玲，伍志坚，侯云德，曾毅
将HIV-1中国株42(B亚型)的gag基因及gag与gp120 V3区的嵌合基因gag V3插入腺病毒伴随病毒(AAV)表达载体pSNAV质粒中,构建重组质粒pSNAV-gag及pSNAV-gagV3;采用脂质体转染的方法分别将重组质粒转入BHK细胞,G418筛选得到转...
关键词：人免疫缺陷病毒1型(HIV-1) 重组腺病毒伴随病毒 细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性

Ad5/F35-LMP1重组腺病毒的构建及鉴定
莫武宁，周玲，吴小兵，王湛，唐安洲，黄光武，曾毅。免疫学技术与方法。中国免疫学杂志,2007年第23卷，251-255。广西医科大学第一附属医院，530021。
目的：构建Ad5F35-LMP2重组腺病毒。方法：分别以EcoR I单酶切pSH-LMP2和pDC316，将LMP2目的基因片段和线性化的pDC316连接，克隆构建pDC316一LMP2，以PCR和酶切的方法鉴定插入方向正确。pDC316．LMP2与腺病毒骨架pBHG．fiber5／35共转染293细胞构建重组腺病毒Ad5F35一LMP2，PCR及间接免疫荧光进行鉴定。结果：经PCR和酶切鉴定证实pDC316．LMP2构建成功。pDC316一LMP2与腺病毒骨架共转染293细胞后见明显的毒斑，说明二者在293细胞中同源重组并包装成功。经PCR证实重组腺病毒Ad5F35一LMP2构建完成，间接免疫荧光鉴定LMP2蛋白能在细胞膜上有效表达。结论：本实验成功构建了含EB病毒LMP2全序列的Ad5F35一LMP2重组腺病毒，为下一步进行该重组病毒生物安全性能和生物学功能研究及今后应用Ad5F35-LMP2重组腺病毒对鼻咽癌患者进行基因免疫治疗奠定了基础。
Ad-LMP2重组腺病毒疫苗在恒河猴体内免疫效果的研究
王湛，周玲，吴小兵，卢觅佳，宣尧仙，左建民，李峰，王琦，叶树清，曾毅。中 华实验和临床病毒学杂志.2006 ； 20（ 2 ）：63-65.中国疾病预防控制中心 肿瘤室,北京100052
目的 观察带有EBV—LMP2的非复制型Ad—LMP2重组腺病毒疫苗免疫恒河猴诱导的针
对EBV—LMP2的特异性细胞和体液免疫应答。方法 分别使用高剂量(4．5×10“VP／kg)、中剂量(1．5×10“VP／kg)、低剂量(0．5×10“VP／kg)三个剂量的Ad—LMP2重组腺病毒，肌内注射免疫恒河猴，每5 d免疫一次，共免疫6次，第7周时使用ELISPOT方法检测猴外周血细胞毒性T细胞应答，同时应用免疫酶方法检测血清中抗LMP2抗体。结果3个剂量免疫恒河猴均可以诱导出有效的细胞免疫应答及一定的抗体应答，免疫应答水平的高低与病毒剂量的高低有一定的关系，较高剂量产生的细胞及体液免疫应答水平比低剂量的要高。抗腺病毒中和抗体和抗LMP2抗体免疫2周后就可以检测到，其中抗LMP2抗体在免疫3—4周时滴度较高，7周时则与3—4周时接近或有所下降。结论 非复制型Ad—LMP2重组腺病毒疫苗可以有效的诱导恒河猴产生EBV—LMP2特异性细胞和体液免疫反应。

Ad5F35-LMP2重组腺病毒免疫效果的研究 (被引用 1 次)
[期刊论文] 《中华实验和临床病毒学杂志》 ISTIC PKU -2007年3期
莫武宁，周玲，吴小兵，王湛，唐安洲，黄光武，余双庆，王琦，叶树清，杜海军，曾毅
目的 了解含有EB病毒潜伏膜蛋白2的非复制型重组腺病毒(Ad5F35-LMP2),免疫恒河猴的特异性细胞和体液免疫的效果.方法 分别使用高剂量(1.5×1010 TCID50/只)、中剂量(1.5×109 TCID50/只)、低剂量(1.5×108 TCID50/只)Ad5F35-...
关键词：重组,遗传 腺病毒,人 疱疹病毒4型,人 膜蛋白质类 恒河猴 免疫,细胞

人源腺病毒伴随病毒Ⅱ型单克隆抗体Fab段及其全抗体的研制 (被引用 1 次)
[期刊论文] 《中华实验和临床病毒学杂志》 ISTIC PKU -2003年3期
姚李四，王涛，梁米芳，袁振华，纪燕，吴小兵，李德新
目的运用噬菌体表面表达技术,获得基因工程抗腺病毒伴随病毒抗体Fab、IgG.方法从酶联免疫吸附试验阳性的人外周血中分离淋巴细胞,提取总RNA,逆转录cDNA,聚合酶链反应扩增人IgG Fab轻、重链基因,利用pComb3载体构建噬菌体抗...
关键词：依赖病毒 免疫球蛋白类,Fab RNA噬菌体 杆状病毒科 基因,昆虫

慢病毒载体工作：

含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的慢病毒载体的制备与表达分析 [期刊论文] 《生物技术通讯》 ISTIC -2011年2期
管洁，王秀平，邓瑶，周为民，吴小兵，谭文杰
目的:制备含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的慢病毒载体,为慢病毒载体的进一步广泛应用奠定基础.方法:克隆构建含分泌型萤光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的转基因载体pCS-gluc-2A-eGFP,酶切与序列分析鉴定其...
关键词：分泌型萤光素酶 双报告基因 慢病毒载体

 

应用于血液病方面的工作：

rAAV 2-GPⅡb/GPⅢa载体构建和体外表达、功能实验 (被引用 1 次)
[期刊论文] 《中国实验血液学杂志》 ISTIC -2006年2期
王凯，彭建强，陈方平，吴小兵
为了研究rAAV载体介导的血小板无力症基因治疗的可行性,构建了由CMV启动子调控的rAAV2-Ⅱb、rAAV2-Ⅲa病毒载体,并采用多种方法验证了rAAV2-Ⅱb和rAAV2-Ⅲa病毒载体在真核细胞中的表达能力,其中包括用RT-RCR方法检测BHK-21细...
关键词：腺相关病毒载体 血小板无力症 血小板膜糖蛋白GPⅡb/GPⅢa

 

使用本公司的质粒pAAV2neo、pAAV2neo-EGFP的其它论文：

疼痛相关融合基因的构建及siRNA 对其抑制作用的研究
陈娜，冯泽国，张，李冠华，王维。军医进修学院学报。 2009 Jun, 30（3）：351-353.解放军总医院　麻醉科，北京　100853。
摘要：目的：通过构建用于RNAi筛选的模拟靶基因，筛选出起作用的siRNA，为进一步研究以Cav2.2 e［ 37a］为靶标的基因治疗提供依据。方法：构建了EGFP-e37a/e37b 融合基因，将其放入载体质粒中进行表达。按照siRNA 的设计原则设计了四对siRNA（ 编码为I号、II号、III 号、IV 号） ，并将其放入质粒表达载体中，用siRNA 表达载体与融合基因表达载体共转染BHK 细胞进行了RNAi 试验。用荧光显微镜、流式细胞仪等方法检测RNAi 效果。结果：EGFP-e37a/e37b 融合基因通过PCR、测序等方法鉴定为正确；在荧光显微镜下可见siRNAII 使细胞的荧光效率明显受到抑制，流式细胞术可见siRNAII 的RNAi 效率在24h 达到了90% 左右，其余3 条siRNA 抑制作用不明显。结论： 本研究将目的基因e37a 与EGFP 基因进行了融合构建，通过EGFP 的绿色荧光效应显示目的靶基因在细胞内的表达，并观察到RNAi 抑制效果，筛选出了有功能的siRNA。

重组人前脑啡肽原基因腺相关病毒载体的构建 (被引用 4 次)
[期刊论文] 《中华麻醉学杂志》 ISTIC PKU -2005年1期
杨辉，田玉科，王鹏，安珂，高峰，吴小兵，梅伟
目的构建重组人前脑啡肽原基因(hPPE)腺相关病毒载体(AAV).方法构建质粒骨架上含有新霉素抗性基因表达盒的重组腺相关病毒(rAAV)载体质粒pSNAV-hPPE并酶切鉴定,转染金黄地鼠胚胎肾细胞(BHK 21),后用G418筛选培养形成稳定...
关键词：脑啡肽类 腺病毒科 遗传载体

改良法构建Ⅱ型重组腺相关病毒介导人TIMP1基因及鉴定
[期刊论文] 《中国普外基础与临床杂志》 ISTIC -2008年12期
李明皓，吴小兵，严律南
目的 改良法构建携带金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)基因的Ⅱ型重组腺相关病毒(rAAV2).方法 采用PCR法从pDNR-LIB质粒中扩增人全长TIMP1基因,利用基因重组的方法 将TIMP1全长cDNA插入通用型AAV2载体质粒pSNAV的多克隆位点,构建...
关键词：白细胞介素-12 融合基因 真核表达 米非司酮

三杆状病毒介导的腺相关病毒载体的生产
雷求刚，徐增辉，钱其军。中国科技论文在线（http://www.paper.edu.cn）。
摘要：由于腺相关病毒(Adeno-associated Viruses, AAV)的非致病性及能感染多种组织类型，重组AAV 载体（rAAV）在基因治疗领域备受关注。然而，如何有效生产rAAV 以适应临床上对其高产量的需求一直是个较大的瓶颈。借助杆状病毒携带rAAV 包装所需组分，通过感染昆虫细胞来生产rAAV 是一种能够解决其产量瓶颈的生产方式。将AAV2 的Rep、 Cap 基因序列以及含AAV2 ITR 及EGFP 表达框的序列分别构建到三个杆状病毒中，通过共感染Sf9 细胞来生产rAAV，结果显示成功包装出rAAV 病毒，且病毒活力较好。这种生产方式很容易放大，将为AAV 载体产业化及临床应用奠定重要基础。